水稻(Oryza sativa L.)分蘖是重要的农艺性状,是增加穗数提高收成的基础,也是判断稻株发育良好与否的重要标志之一,适当的增加分蘖数可以在一定程度上使水稻单株产量有效提高。影响水稻分蘖的因素很多,不仅受到来自外部的日照条件、营养物质、气候条件和水分等环境因素的影响,也受到植物激素、品种等种子自身根本原因的调控。目前,植物激素在调控水稻分蘖方面的作用,依旧是研究的重点,不断有新的证据指出不同激素在分蘖发育中的作用。其中,生长素是第一个被发现的植物激素,虽然生长素被广泛认为主要是通过植物顶端优势参与了对分蘖的抑制作用,但其具体机制仍旧不明确,缺乏系统及深入的研究。为进一步探索水稻分蘖发育的分子机理,从籼型水稻西大1B甲基磺酸乙酯(EMS)诱变库中,筛选鉴定出一个半矮化多蘖水稻突变体htsd1(high tillering and semi-dwarf 1),通过基因精细定位、表型鉴定、细胞学观察及一系列生物学实验分析,对突变基因在水稻分蘖发育中的作用机理进行了研究。得到主要研究成果如下:1.htsd1是一个半矮化多蘖突变体田间种植条件下,突变体htsd1与野生型相比表现出分蘖显著增多的特点,且htsd1分蘖数在全生育期呈持续增加的趋势。对分蘖芽进行石蜡切片观察,结果表明突变体htsd1并没有形成更多的分蘖芽,但是每一个分蘖芽均长于对应的野生型分蘖芽,证明突变体htsd1分蘖芽生长的抑制作用被解除,从而导致水稻植株分蘖数增多。突变体htsd1还表现出在全生育期植株均矮于野生型,通过统计数据发现,突变体htsd1穗长及各节间长度均显著缩短。石蜡切片及电镜扫描结果证实,突变体htsd1叶鞘细胞的宽度以及茎秆细胞长度和宽度均较之野生型缩短,说明突变体htsd1矮化是由Magnetic biosilica于细胞缩小变短导致的。突变体htsd1单株产量随有效穗增加而显著提高,是一个优良的水稻种质资源。2.HTSD1是一个新的OsAUX1等位突变基因利用丙烯酰胺凝胶电泳及全基因组测序技术对HTSD1Dibutyryl-cAMP采购进行精细定位,发现位于定位区间内注释基因LOCGSK1349572细胞培养＿Os01g63770/OsAUX1的第三外显子上,出现了一个由T到C的碱基替换,造成编码的氨基酸由WT中的酪氨酸(Tyr)变成了htsd1中的组氨酸(His)。进一步利用转基因技术,验证HTSD1是一个新的OsAUX1等位突变基因。通过生物信息学分析,发现水稻与拟南芥中AUX家族基因结构高度保守,且均含有一个Aa＿trans结构域,突变位点发生于该结构域内,这一结果暗示该基因功能的改变可能与该结构域的改变有关。3.OsAUX1在分蘖芽处有较高表达qRT-PCR结果显示,OsAUX1虽然在各处都有表达,但在根部及分蘖芽表达要高于其他部位。OsAUX1自身启动子+GUS转基因植株的GUS检测,同样证实在各植株组织部位能检测到GUS染色。利用原位杂交技术,发现在分蘖芽处OsAUX1表达较高。4.OsAUX1通过激素途径调控水稻分蘖芽生长与WT相比,突变体htsd1根部表现出明显的生长素缺乏所导致的特点。通过生长素处理,发现突变体htsd1需要更高浓度的生长素才能抑制其根部生长,这表明htsd1是一个生长素不敏感突变体。在突变体htsd1中,许多生长素相关基因的表达水平发生改变,外施生长素能抑制其分蘖发生。SL通路相关基因表达水平也发生了改变,且OsAUX1对独角金内酯的人工合成类似物rac-GR24信号和生长素信号有所响应。这些结果暗示,OsAUX1可能通过参与生长素途径,并与独角金内酯途径共同影响水稻分蘖。5.OsAUX1通过生长素作用于TB1调控水稻分蘖qRT-PCR和原位杂交结果发现TB1在水稻突变体htsd1分蘖芽处表达显著下降。利用CRISPR/Cas9技术创制TB1突变体Cas9~(TB1),其分蘖数极显著增多,外施生长素可以抑制其分蘖发生。此外,TB1同样可以响应IAA和rac-GR24,根据以上结果推测OsAUX1可能通过影响生长素作用于TB1,参与到对水稻分蘖调控的通路中。6.OsAUX1是SPL7的靶基因OsAUX1启动子上存在五个-GTAC-位点,是Squamosa启动子结合蛋白(SPL)结合DNA的核心位点。双荧光素酶实验及酵母单杂交实验证明SPL7可以与OsAUX1启动子区域上GTAC序列结合,并激活其表达。在突变体htsd1中,多个SPL家族成员表达水平降低,推测可能存在其他SPL家族成员与SPL7共同作用调控OsAUX1的表达。