目的:胃癌(GC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。尽管在早期诊断和临床治疗方面取得了进步,但由于顺铂等化疗药物耐药性的产生,胃癌患者的预后仍然很差。环状RNA(circRNAs)是一类新的非编码RNA,具有高度保守的闭环结构。既往文献显示circRNA在胃癌耐药中扮演重要角色Recipient-derived Immune Effector Cells,竞争性结合微小RNA(miRNA),调控miRNA靶基因的表达,进而发挥细胞恶性生物学功能。前期研究发现circHIPK3促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,但circHIPK3是否调控胃癌顺铂耐药性尚未可知。因而,本研究探讨circHIPK3对胃癌细胞顺铂耐药性的影响,及CHIR-99021作用circHIPK3/miR-508-3p/Bcl-2/Beclin1/SLC7A11轴与自噬相关性铁死亡在胃癌耐药中的作用机制。方法:以 AGS/DDP,HGC-27/DDP 细胞为研究对象,在 AGS/DDP 和 HGC-27/DDP细胞中过表达和沉默circHIPK3。1、RT-qPCR检测顺铂敏感和耐药的胃癌组织及顺铂敏感和耐药的胃癌细胞系中circHIPK3的表达水平。CCK-8、EdU、克隆形成实验研究circHIPK3对胃癌耐药细胞株增殖能力的影响;检测顺铂IC50值;进行裸鼠皮下成瘤实验,分为NC+DDP组、circHIPK3+DDP 组、si-Control+DDP 组、si-circHIPK3+DDP 组,分别测量荷瘤的体积和重量;RT-qPCR检测荷瘤中circHIPK3的表达水平。2、流式细胞术、TUNEL实验检测细胞凋亡水平;western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、和P62的表达量;LC3双荧光自噬慢病毒检测自噬通量变化。使用自噬抑制剂3-MA研究自噬在circHIPK3调控的顺铂耐药中所起的作用。3、Erastin和sorafenib处理细胞后,检测细胞内的活性氧(ROS)、脂质过氧化产物MDA、Fe2+和还原型谷胱甘肽(GSH)水平,透射电镜检测细胞线粒体变化,分析circHIPK3对胃癌顺铂耐药株的铁死亡作用。使用自噬激活剂雷帕霉素和抑制剂3-MA,研究耐药株中自噬对铁死亡的调控作用。4、RT-qPCR和FISH研究circHIPK3在胃癌耐药株的定位;通过Starbase、CircBank、Circular RNA Interactome,预测 circHIPK3 的下游靶点 miR-508-3p,以及 miR-508-3p 的下游靶向基因Bcl-2;双荧光素酶实验验证circHIPK3和miR-508-3p以及miR-508-3p与Bcl-2的靶向关系。5、在 AGS/DDP 和 HGC-27/DDP 细胞中分别转染 circHIPK3、miR-508-3p mimics和 si-circHIPK3、anti-miR-508-3p,western blot 检测 caspase3、cleaved caspase 3、Bcl-2、LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、和P62蛋白水平,分析circHIPK3/miR-508-3p轴对细胞凋亡、自噬的影响。检测ROS、MDA、Fe2+和GSH水平,研究circHIPK3/miR-508-3p轴对细胞铁死亡的影响。使用Bcl-2抑制剂Obatoclax Mesylate,研究miR-508-3p/Bcl-2分子轴对胃癌耐药细胞株自噬的影响。6、在过表达或沉默circHIPK3的AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中转染BECN1,western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、和P62以及细胞铁死亡水平的变化,Co-IP验证Beclin1和SLC7A11相互结合。7、电镜、NTA和western blot验证血清和细胞上清提取的外泌体,RT-qPCR检测胃癌敏感株和耐药株细胞上清外泌体中circHIPK3的水平,检测顺铂耐药和顺铂敏感患者血清外泌体中的circHIPK3水平以及顺铂治疗前后患者血清外泌体circHIPK3的变化。结果:1、顺铂耐药的胃癌组织中circHIPK3的水平明显高于顺铂敏感组织,AGS/DDP、HGC-27/DDP和MKN-28/DDP细胞的circHIPK3表达水平明显高于亲本细胞。过表达circHIPK3后AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞的顺铂IC50值增加,细胞增殖能力增加(P<0.05);沉默circHIPK3则抑制了 GC/DDP的细胞增殖,IC50值减小(P<0.05)。与对照组相比,circHIPK3+DDP组中的荷瘤体积、重量、circHIPK3表达水平明显增高(P<0.05);而si-circHIPK3+DDP组的荷瘤体积、重量、circHIPK3表达水平明显降低(P<0.05)。2、过表达 circHIPK3 抑制 AGS/DDP 和 HGC-27/DDP 的凋亡和自噬(LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少,P62表达增加)(P<0.05);沉默circHIPK3则促进AGS/DDP和HGC-27/DDP的凋亡和自噬(LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达升高,P62表达下降)(P<0.05)。与对照组相比,沉默circHIPK3后,顺铂对细胞的IC50值减小。加入3-MA抑制自噬后,si-circHIPK3组的IC50值变大(P<0.05)。3、Erastin和sorafenib处理后,过表达circHIPK3抑制细胞铁死亡(P<0.05);沉默circHIPK3则促进细胞铁死亡(P<0.05)。线粒体电镜显示,与对照组相比,过表达circHIPK3的AGS/DDP细胞在经过erastin处理后,线粒体形态变化不如对照组明显(线粒体缩小,线粒体膜密度增加,线粒体嵴减少或丢失)。此外,加入雷帕霉素后,细胞的铁死亡水平被激活;加入3-MA后,铁死亡则被抑制(P<0.05)。4、RT-qPCR和FISH验证circHIPK3主要定位于胞质,双荧光素酶证明circHIPK3靶向结合 miR-508-3p;miR-508-3p 靶向结合 Bc1-2。5、与 circHIPK3+miR-NC mimics 相比,circHIPK3+miR-508-3p mimics 组细胞的凋亡、自噬、铁死亡水平升高(P<0.05);与si-circHIPK3+anti-miR-NC相比,si-circHIPK3+anti-miR-508-3p组细胞的凋亡、自噬、铁死亡水平下降(P<0.05)。使用Bcl-2抑制剂Obatoclax Mesylate后,miR-508-3p诱导的自噬激活被进一步促进。6、Co-IP显示GC/DDP细胞中,Beclin1和SLC7A11结合。转染BECN1后恢复了circHIPK3介导的自噬抑制和铁死亡抑制。7、电镜、NTA和western blot验证了外泌体,RT-qPCR表明胃癌耐药细胞上清外泌体中的circHIPK3水平高于胃癌敏感细胞上清外泌体。与胃癌顺铂化疗敏感的患者相比,顺铂耐药患者血清外泌体中circHIPK3水平升高。患者在经过顺铂治疗后,血清外泌体中的circHIPK3水平下降(P<0.05)。结论:CircHIPK3促进胃癌耐药株的增殖和耐药,抑制凋亡、自噬和铁死亡。CircHIPK3 靶向结合 miR-508-3p,通过 miR-508-3p/Bcl-2/Beclin1/SLC7A1 1 轴介导自噬依赖性铁死亡,促进顺铂耐药。另一方面,经过顺铂治疗后患者血清外泌体中circHIPK3水Pevonedistat平下降,提示血清外泌体circHIPK3可能成为评估胃癌患者化疗效果的无创指标。