香菇(Lentinula edodes)是久负盛名的美味食用菌之一,我国最早开始半人工栽培。近年来随着全球气候变暖,热胁迫对香菇生产的不利影响日益严重,甚至引起香菇菌棒大量腐烂,常造成重大的经济损失。在植物热胁迫研究中发现,生长素信号转导在响应热胁迫应激响应中起着关键作用,生长素信号通过SCF~(TIR1)复合体(SKP1,Cullin and F-box complex)传递至细胞核内,但至今尚无生长素在真菌逆境胁迫应激响应中信号转导通路的研究报道。本实验室前期研究发现,生长素(IAA)与香菇菌丝耐热性有关,外源添加IAA或其类似物NAA、2,4-D可以显著提高香菇菌丝耐热能力,并且已筛选到与生长素响应元件“TGTCGG”相互作用的LeSKP1(S期激酶关联蛋白1)蛋白。本研究运用酵母双杂交技术和pull down技术分析了LeSKP1蛋白与F-box蛋白及Cullin蛋白的相互作用,采用q RT-PCR分析明确了LeSKP1基因响应IAA信号的寻找更多表达模式,运用RNAi技术分析了香菇热敏感菌株YS48和耐热菌株YS3334中LeSKP1基因功能,对香菇LeSKP1基因开展了系统研究。选择对IAA不敏感的菌株YS48和YS3334以及对IAA敏感的菌株YS3355和Z60,常温下用0.01 m M IAA处理5 min,运用转录组测序技术分析挖掘生长素快速响应基因。主要研究结果如下:1.对LeSKP1蛋白进行分析发现,LeSKP1蛋白与拟南芥ASK1蛋白高度同源,序列相似度为51.90%,序列匹配程度为96%,且香菇中仅有1个LeSKP1基因。运用酵母双杂交技术和pull down技术明确了LeSKP1蛋白和ASK1蛋白均与香菇F-box蛋白Le01GeneEpimedii Folium01446相互作用,表明LeSKP1蛋白与ASK1蛋白可能具有相似的功能。2.外源0.01 mM IAA分别处理YS48和YS3334菌株5 min、30 min、1 h、2 h和6 h。q RT-PCR检测LeSKP1基因表达量发现,YS48菌株在IAA处理1 h后LeSKP1基因表达量显著下调,YS3334菌株在IAA处理5 min后LeSKP1基因表达量略有上调。研究结果表明,香菇LeSKP1基因在短时间内不响应外源IAA。3.采用农杆菌介导香菇菌丝遗传转化方法进行LeSKP1基因沉默,筛选阳性转化子,以转入p CAMBIA1300-RNAi空载的菌株为对照。结果发现,在YS48菌株中筛选到BMN 67311个阳性转化子,其中3个阳性转化子LeSKP1基因表达量下调至对照菌株的70%;在YS3334菌株中筛选到12个阳性转化子,且LeSKP1基因表达量均下调至对照菌株的57%。进一步测定菌丝生长速度,发现LeSKP1基因表达量下调对香菇YS48和YS3334菌丝生长速度没有明显影响。对香菇菌丝的耐热性进行测定发现,香菇YS48和YS3334菌株不同转化子的耐热表型变化不一致。4.外源加IAA检测YS48、YS3334、YS3355和ZP60菌丝生长速度,发现菌株YS48和YS3334为常温下对0.01 m M IAA不敏感的菌株,YS3355和ZP60为常温下对0.01 m M IAA敏感的菌株。外源添加生长素合成抑制剂Yucasin,检测4个供试菌株的菌丝生长速度和内源IAA含量,结果表明,低浓度IAA促进菌丝生长,高浓度IAA抑制菌丝的生长,与IAA对植物的作用类似。5.运用转录组测序技术挖掘香菇对生长素短时响应的基因。在菌株YS3355中鉴定到64个差异表达基因,在菌株ZP60中鉴定到47个差异表达基因,但在菌株YS3334和YS48中未鉴定到差异表达基因。对差异基因进行GO富集分析发现,YS3355菌株DEGs富集到与裂解酶活性、磷酸吡哆醛结合等相关的功能;ZP60菌株DEGs富集到氧化还原酶活性、过氧化物酶活性、抗氧化活性、转录调节活性等相关功能。本研究初步明确了香菇LeSKP1基因在热胁迫应激响应中的功能,明确了生长素对香菇菌丝生长的影响,挖掘了生长素快速响应基因,为研究香菇生长素信号转导途径和揭示生长素调控香菇耐热性的分子机制奠定了基础,有利于进一步开展香菇耐高温种质创新研究。