目的:探究烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)的外源性补充对急性大强度运动大鼠心肌氧化应激损伤是否产生保护作用,为NMN预防运动性心肌损伤的研究提供参考依据。方法:以56只7周龄雄性SD大鼠为实验对象,将其随机分为5组:安静对照组(C,n=8)、运动对照组(CE,n=12)、低剂量NMN预处理运动组(LNE,n=12)、中剂量NMN预处理运动组(MNE,n=12)、高剂量NMN预处理运动组(HNE,n=12)。适应性喂养后,NMN补充组按大鼠体重灌以低(100 mg/kg)、中(300mg/kg)、高(500 mg/kg)三种不同浓度的NMN溶液,C组和CE组每日灌以等体积的生理盐水,每日1次,共进行4周。最后一次灌胃1 h后,所有运动组(CE、LNE、MNE、HNE组)大鼠均在倾角为10%的跑台上进行为时1 h,速度27 m/min的急性大强度运动。运动1 h后,每组随机选取4只大鼠继续运动至力竭,记录力竭时间;其余大鼠均即刻停止运动。急性大强度运动结束后2h对大鼠进行取材。光学显微镜观察大鼠心肌组织HE染色切片,透射电镜观察大鼠心肌组织电镜切片,ELISA测定大鼠血清中心肌损伤标志物c TDS-3201研究购买n I、CK-MB、NT-pro BNP水平及炎症因子IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10水平,Western blot检测凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达水平,反映大鼠心肌损伤程度;DHE染色检测心肌组织ROS水平,试剂盒检测脂质过氧化产物MDA含量及抗氧化物SOD、GPx、CAT的活性等,反映大鼠心肌氧化应激损伤程度;试剂盒检测心肌组织NAD~+、NADH水平及NAD~+/NADH比率,反映NMN进入心脏并增强细胞NAD~+水平的能力;Western blot检测大鼠心肌Sirt1、Nrf2、HO-1的蛋白表达水平,反映NMN补充对该氧化应激反应相关信号通路的影响;采用Graphpad Prism 8.0.1软件进行数据统计分析与绘图。结果:(1)NMN对大鼠体重的影响。不同浓度的NMN外源性补充均对健康大鼠体重无显著影响。(2)NMN对大鼠力竭时间的影响。与CE组相比,MNE组、HNE组大鼠力竭运动时间的均值分别延长9.39%、16.97%、17.27%,其中,MNE和HNE组大鼠的力竭运动时间显著延长(P<0.05),LNE组大鼠的力竭时间有增加趋势,但无显著差异(P>0.05)。结果表明,NMN能够延长大鼠力竭时间,提高大鼠运动能力,中、高剂量效果较好。(3)NMN对急性大强度运动大鼠心肌损伤的影响。(1)与C组相比,CE组心肌损伤标志物c Tn I、CK-MB及NT-pro BNP的含量均显著升高(P<0.01);与CE组相比,LNE、MNE和HNE组c Tn I、CK-MB和NT-pro BNP水平均显著降低(P<0.05)。(2)与C组相比,CE组心肌纤维排列紊乱,细胞肿胀、轮廓模糊,炎性细胞浸Brain Delivery and Biodistribution润;与CE组相比,LNE、MNE及HNE组形态结构变化较小,MNE组和HNE组效果尤为明显。(3)与C组相比,CE组促炎因子IL-6、TNF-α显著增多(P<0.01),抗炎因子IL-4、IL-10水平显著降低(P<0.05);与CE组相比,MNE组和HNE组TNF-α水平显著下降(P<0.05),且HNE组IL-10水平显著升高(P<0.05)。(4)与C组相比,CE组大鼠心肌Bax和Caspase-3的蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);与CE组相比,LNE、MNE和HNE组大鼠心肌Caspase-3水平显著降低(P<0.05),且MNE和HNE组大鼠心肌Bax水平显著降低(P<0.05)。结果表明,NMN补充能够对急性大强度运动诱导的心肌损伤产生保护作用,中、高剂量效果较好。(AY-22989细胞培养4)NMN对急性大强度运动大鼠心肌氧化应激水平的影响。与C组相比,CE组大鼠心肌组织中ROS水平显著升高(P<0.01);与CE组相比,LNE、MNE和HNE组其均值分别降低19.49%、32.63%、35.66%,均为显著性降低(P<0.05)。与C组相比,CE组大鼠心肌MDA水平显著升高(P<0.01);与CE组相比,LNE、MNE和HNE组其均值分别降低18.88%、30.45%、33.47%,均为显著性降低(P<0.05)。与C组相比,CE组大鼠心肌组织中抗氧化酶SOD、CAT及GPx活力无显著变化(P>0.05);但与CE组相比,LNE组、MNE和HNE组大鼠心肌抗氧化酶活力均有升高趋势,SOD活力均值分别升高12.27%、20.41%和23.55%,CAT活力均值分别升高12.83%、20.58%和21.9%,GPx活力均值分别升高12.27%、18.41%和18.23%,其中,LNE组三种抗氧化酶活力与CE组之间不存在显著性差异(P>0.05),MNE和HNE两组较CE组大鼠心肌抗氧化酶活力显著升高(P<0.05)。结果表明,NMN一方面能减轻急性大强度运动大鼠心肌氧化应激损伤,另一方面能提高其心肌抗氧化能力,因而对急性大强度运动诱导的心肌氧化应激损伤起到保护作用,其中,中、高剂量效果较好。(5)NMN对急性大强度运动大鼠NAD~+、NADH水平及NAD~+/NADH比率的影响。与C组相比,CE组大鼠心肌NAD~+水平显著降低(P<0.05);与CE组相比,LNE、MNE和HNE组大鼠心肌NAD~+水平均值分别提高16.83%、25.66%、30.67%,其中,MNE和HNE组大鼠心肌NAD~+水平显著升高(P<0.05)。与NAD~+水平相反,与C组相比,CE组大鼠心肌NADH水平显著升高(P<0.01);与CE组相比,LNE、MNE和HNE组大鼠心肌NADH水平均值分别降低13.65%、20.08%、20.07%,其中,MNE组和HNE组显著降低(P<0.05)。与C组相比,CE组大鼠心肌NAD~+/NADH水平显著降低(P<0.01);与CE组相比,LNE、MNE和HNE组大鼠心肌NAD~+/NADH比值的均值分别提高36.01%、59.92%和65.00%,其中MNE组和HNE组显著升高(P<0.01)。结果表明,NMN补充能增加急性大强度运动大鼠心肌NAD~+水平,减少大强度运动导致的NADH堆积,提高NAD~+/NADH比值,从而保证氧化还原反应的正常进行和下游信号通路的激活,中、高剂量效果较好。(6)NMN对急性大强度运动大鼠氧化应激通路Sirt1/Nrf2/HO-1的影响。免疫组织化学法可得,与C组相比,CE组大鼠心肌Sirt1水平显著下降(P<0.05);与CE组相比,MNE和HNE组其表达量显著升高(P<0.01);与LNE组相比,HNE组其表达量显著升高(P<0.05)。Western blot实验可得,与C组相比,CE组大鼠心肌Sirt1蛋白表达显著降低(P<0.05);与CE组相比,MNE和HNE组大鼠心肌Sirt1蛋白表达量显著升高(P<0.01);与LNE组相比,HNE组大鼠心肌Sirt1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与CE组相比,MNE组和HNE组大鼠的心肌细胞核Nrf2水平、心肌细胞HO-1水平均显著升高(P<0.05)。结果表明,NMN补充能激活急性大强度运动大鼠Sirt1/Nrf2/HO-1信号通路,其中,中、高剂量,尤其是高剂量效果较好。研究结论:4周NMN外源性补充能够降低急性大强度运动大鼠的ROS和MDA水平,并提高大鼠抗氧化酶SOD、CAT及GPx活性,减轻心肌氧化应激反应,从而对细胞肿胀、炎症、凋亡等相关心肌损伤产生保护作用,提高大鼠运动能力。其机制可能与NAD~+水平的提高及Sirt1/Nrf2/HO-1信号通路的激活有关。中、高剂量的NMN补充效果较好。