脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CI/RI)是临床治疗面临的重大挑战,是缺血性脑卒中关键的病理过程,其特征在于最初限制大脑的血液供应,随后再灌注复氧,导致脑组织严重受genetic swamping损。星形胶质细胞作为脑组织中数量最多的细胞,在CI/RI中对神经元具有重要的调控和保护作用。激活素A(activin A,ActA)是TGF-β超家族的成员,广泛表达在多种组织中,在增殖、分化、凋亡和炎症中发挥重要的生理作用。ActA主要通过Smads通路及非Smad依赖性途径如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)参与调控。MAPK信号级联反应在神经系统的形成、神经退行性疾病以及大脑的疼痛和炎症反应发挥重要作用。铁死亡是一种新发现的铁离子依赖性的细胞死亡形式。近年研究显示,铁死亡在神经退行性疾病、脑卒中等疾病的病理生理过程中发挥重要的作用。研究表明,CI/RI过程中神经元会发生铁死亡进而加剧损伤,而ActA对缺血性脑卒中神经元起保护作用,但对星形胶质细胞的影响知之甚少。综上,本研究拟探讨ActA对糖氧剥夺/复氧(oxygen Glucose Deprivation,OGD/R)星形胶质细胞的作用和机制,为进一步探索治疗CI/RI的新手段提供新思路。目的:探讨ActA对糖氧剥夺/复氧(OGD/R)星形胶质细胞的作用和分子机制。方法:1.取24h内新生C57BL/6小鼠大脑皮质分离培养,纯化原代星形胶质细胞,GFAP免疫荧光染色鉴定。2.CCK8检测OGD 2h、4h、6h和OGD/R 6h、12h、24h、48h星形胶质细胞的活力。3.Mito-Tracker Red CMXRos染色、ROS试剂盒、脂质氧化试剂盒、铁离子试剂盒以及Western Blot检测对照组、OGD/R组及OGD/R+ActA组的线粒体活性、铁死亡相关指标以及铁死亡相关蛋白表达水平的变化。4.Western Blot检测对照组、OGD/R组及OGD/R+ActA组MAPK信号通路相关蛋白表达水平的变化。5.Mito-Tracker Red CMXRos染色、ROS试剂盒、脂质氧化试剂盒、铁离子试剂盒以及Western Blot检测对照组、OGD/R组、OGD/R+ActA组、OGD/R+MAPK抑制剂、OGD/R+MAPK抑制剂+ActA组的线粒体活性、铁死亡相关指标以及铁死亡相关蛋白表达水平。结果:1.GFAP免疫荧光检测纯度大于95%。2.CCK8结果显示,与对照组相比,OGD 6h组细胞存活率下降至55.6%(v.s con,P<0.01),OGD 6h/R 24h组细胞存活率下降至46.8%(v.s con,P<0.01)而OGD 6h/R 48h组细胞存活率下降至27.3%(v.s con,P<0.01)。给予20 ng/m L ActA各个时间点与对照组相比细胞的存活率均有显著差异(P<0.01)。因此,本实验选择OGD6h/R 24h给予20 ng/m L ActA进行后续的研究。3.星形胶质细胞在OGD 6h/R 24h时线粒体活性显著下降,ROS、MDA及Fe~(2+)生成显著增多,加入ActA可见线粒体活性改善,ROS、MDA及Fe~(2+)生成显著降低。4.Western Blot结果显示,OGD 6h/R 24h组FPN1及GPX4表达水平降低,TF及TFR表达量升高,给予ActA后FPN1及GPX4表达水平显著增加,TF及TFR表达量显著下降。JNK、P-JNK、P38及P-P38表达水平显著升高,而ERK及P-ERK表达量降低,给予ActA后均显著降低。5.加JNK或P38抑制剂组相比OGD/R组线粒体活性均显著升高,ROS、MBYL719DA及Fe~(2+)生成显著减少;在同时给予ActA及JNK/P38抑制剂时,线粒体活性显著增加、ROS、MDA及Fe~(2+)生成显著减少。6.Western Blot检测显示,加JNK/P38抑制剂组相比OGD/R组GPX4表达增加,TF、TFR表达均显著下降,FPN1表达无显著变化;同时给予ActA和JNK/P38抑制剂时,与ActA组和JNK/P38抑制剂组相比,GPX4表达显著升高,TF和TFR表达显著降低。结论PR-171临床试验:1.ActA能抑制OGD/R诱导的星形胶质细胞铁死亡,减轻OGD/R时星形胶质细胞的损伤;2.ActA可能通过抑制MAPK通路中JNK及P38的表达,从而促进GPX4的表达、抑制TF及TFR的表达抑制铁死亡,发挥对星形胶质细胞OGD/R损伤的保护作用。