研究背景膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是骨科临床上常见的一种疾病,从KOA早期出现关节痛,到中期关节僵硬、肿胀、夜间痛,后期关节畸形、功能活动受到明显限制,严重影响了患者的生活质量。肥胖、合并症、职业因素、体力活动、生物力学因素和饮食暴露等因素均是KOA危险因素。流行病学资料显示中国40岁以上人群原发性KOA总体患病率为46.3%,70岁以上患病率为62.1%,呈现随年龄增长而增高的趋势,同时也说明KOA的发病趋向于年轻化。因此KOA的深入研究对于提高人民生活质量、减轻医疗负担,进一步实现健康中国战略具有重大的意义。早期KOA的治疗,多个指南均推荐首选外用非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs,NSAIDs)治疗,避免口服带来的副作用。然而部分患者局部外用NSAIDs存在皮肤发红、刺痛、瘙痒等不良反应,且长期使用带来的副作用目前未知。海桐皮汤出自《医宗金鉴·正骨心法要旨》,具有活血散瘀,通络止痛之功效,主要用于治疗各种急慢性损伤所导致的骨与关节以及软组织的病症,为治疗“筋翻骨错疼痛”的名方。导师张清主任医师应用海桐皮方熏洗有20余年经验,该方治疗KOA患者具有良好效果。本研究基于海桐皮方新药研发课题,拟将海桐皮方转化为温凝胶膏剂型,目前已完成优化的海桐皮方提取膏制备,并前期研究已证实海桐皮方提取膏具有抗炎镇痛的作用。但目前该方的药效物质基础、作用机制不明,深入研究对于海桐皮方研发以及发挥中药外用优势具有重要的科学价值。本研究中第一部分采用随机对照试验验证海桐皮方熏洗治疗KOA的有效性和安全性,为海桐皮方熏洗治疗KOA的推广应用提供新的临床循证依据。第二部分验证海桐皮方提取膏治疗KOA大鼠的药效。第三部分,首先采用UPLC-Q-TOF-MS技术鉴定海桐皮方提取膏透皮后的活性成分并进行分析,为研究作用机制提供药效物质基础。然后分别从网络药理学和代谢组学两个层面探究其作用靶点和通路,最后联合分析筛选出关键作用靶点、共有通路以及相关透皮成分,通过体内试验及分子对接技术对作用关键通路及透皮成分进行验证,为后续海桐皮方新药研发及深入研究其作用机制奠定了实验基础。研究内容研究内容一海桐皮方熏洗治疗膝骨关节炎的临床疗效评价目的:验证海桐皮方熏洗治疗KOA的有效性和安全性,为该方的临床推广应用提供新的循证医学证据。方法:纳入病例均来源于望京医院骨科门诊,病例收集时间为2021年12月-2022年9月,共招募符合纳入标准的KOA患者70例,按随机数表法随机分为试验组和对照组,每组各35例。在健康教育和运动疗法(股四头肌等长锻炼、直腿抬高锻炼)的治疗基础上,对照组加外用双氯芬酸二乙胺乳胶剂,试验组加海桐皮方熏洗。以3周为1疗程,并在治疗1周、治疗3周和结寻找更多束治疗后1个月、2个月进行随访。本部分研究以VAS评分、WOMAC评分(疼痛、关节僵硬和功能评分)、中医证候积分、压痛值和不良反应为观察指标。结果:本研究总共65例完成随访,5例脱落或剔除。两组患者观察指标的基线水平无显著性差异(P>0.05)。(1)VAS评分:与治疗前相比,两组患者的VAS评分均下降,各随访点均存在统计学差异(P<0.05)。与对照组相比,试验组治疗1周时无明显差异(P>0.05),在治疗3周及以后随访点均低于对照组,存在统计学差异(P<0.05)。同组治疗后1月及治疗后2月无明显差异(P>0.05)。(2)WOMAC评分:①两组各访视点的WOMAC总分均低于治疗前,结果存在统计学差异(P<0.05)。与对照组相比,试验组除治疗前、治疗第1周无明显差异(P>0.05),余访视点均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。同一组的WOMAC总分均呈下降趋势,且各访视点之间存在统计学差异(P<0.05)。②在WOMAC疼痛评分比较中,与治疗前相比,两组各访视点的WOMAC疼痛评分均低于治疗前,结果存在统计学差异(P<0.05),与对照组相比,试验组除治疗前无明显差异(P>0.05),余访视点均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。同组不同访视点比较中,治疗后1月以前WOMAC疼痛评分下降程度与时间呈正相关(P<0.05),但治疗后1月与治疗后2月无明显变化(P>0.05)。③与WOMAC功能评分的比较中,与治疗前相比,两组各访视点的WOMAC功能评分均低于治疗前,结果存在统计学差异(P<0.05)。同一组的WOMAC功能评分均呈下降趋势,且各访视点之间存在统计学差异(P<0.05)。与对照组相比,试验组除治疗前、治疗第1周无明显差异(P>0.05),余访视点均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。④对WOMAC关节僵硬积分进行秩和检验:在每一个访视点试验组和对照组均未表现出明显的差异性(P>0.05),从纵向看,各访视点两组患者的关节僵硬改善程度与时间呈正相关,且存在统计学差异(P<0.05)。(3)中医证候积分:与对照组比较,各访视点试验组均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。同一组的中医证候评分均呈下降趋势,各访视点之间存在统计学差异(P<0.05)。(4)压痛值:两组患者的压痛值较前均有所提高,试验组效果较对照组更佳,结果存在统计学差异(P<0.05)。患者的压痛值成上升趋势,AY-22989半抑制浓度各访视点之间存在统计学差异(p<0.05)。(5)不良反应:两组患者对照组1人出现过轻度敏反应,试验组未出现。结论:在运动疗法基础上,海桐皮方熏洗能够较好的改善KOA患者的疼痛,促进膝关节功能的恢复,提高压痛阈值,且安全性较高。研究内容二海桐皮方提取膏动物药效学验证目的:验证海桐皮方提取膏治疗KOA大鼠的药效。方法:采用木瓜蛋白酶与半胱氨酸混合注射建立大鼠KOA模型并评价。大鼠共分为6组:空白组(Control,C)、模型组(Model,M)、海桐皮方提取膏低剂量(Low Dosage,LD)、中剂量组(Medium Dosage,MD)、高剂量组(High Dosage,HD)、双氯芬酸二乙胺乳胶剂组(Voltaren,V)。C、M组均不给予药物干预。LD、MD、HD组的给药剂量分别为0.48g/100g、0.96g/100g、1.92g/100g,V组给予双氯芬酸二乙胺乳胶剂0.48g/100g外涂。采用Von Frey纤维丝检测大鼠机械性疼痛阈值,热辐射疼痛测试仪测定大鼠热缩爪潜伏期。药物持续干预4周后取大鼠血清和软骨,采用HE、番红O-固绿染色观察KOA大鼠软骨组织的病理改变,ELISA测定大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,以及免疫组织化学染色检测大鼠膝关节软骨中MMP13及COL2的表达。结果:造模后大鼠右膝关节一般情况、影像学MRI、软骨病理学HE、番红O-固绿染色等结果符合KOA大鼠模型标准。行为学实验结果中:各组大鼠PWT、PWL值比较,LD、MD、HD组均与M组差异有统计学意义(P<0.05),且升高程度与海桐皮方提取膏浓度呈正相关,HD组与V组无明显差异(P>0.05);各组大鼠膝关节直径比较,总体上LD、MD、HD组与M组比较均能减小膝关节肿胀程度,且HD组效果最好,H D组与V组无明显差异(P>0.05)。大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量检测结果显示与C组比较,M组明显增高,总体上LD、MD、HD组与M组比较均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),且下降程度与海桐皮方提取膏浓度呈正相关。在HE、番红O-固绿染色中发现,LD、MD、HD组相较于M组软骨受损程度均有好转,且随浓度增加,效果越佳。Mankin和OARSI组织学评分中给药组评分均明显降低,以HD组海桐皮方提取膏效果最显著。免疫组化结果中:COL-2A1在C组的表达最高且明显高于M组,LD、MD及HD组随着用药剂量的增加,COL-2A1的表达逐渐增加,并且L D、MD、HD组与M组相比均具有显著差异性(P<0.001),V组COL-2A1表达与H D组相比差异不明显(P>0.05);MMP-13在M组表达量最高,在给药组中LD、MD及HD组表达量逐渐降低,HD组表达量最低与V组无明显差异(P>0.05)。结论:海桐皮方提取膏可以改善KOA大鼠一般状态、软骨组织病理形态及机械性疼痛阈值,降低血清IL-1β、TNF-α、IL-6炎性因子的水平,同时抑制软骨MMP-13表达,促进软骨中Ⅱ型胶原的积累,延缓ECM的降解。证明海桐皮方提取膏干预KOA大鼠模型具有抗炎、镇痛,减轻软骨退变的作用。研究内容三基于网络药理和代谢组学探讨并验证海桐皮方提取膏干预KOA作用机制第一节:海桐皮方提取膏透皮成分分析目的:初步鉴定海桐皮方提取膏透皮后的化学成分。方法:用脱毛膏去除小鼠腹部的毛,采用脱颈的方法处死,小心取下足够的腹部皮肤。采用改良Franz扩散池法进行海桐皮方提取膏透皮成分分析的供试品制备,将小鼠腹部皮肤的角质层一侧面向供给池,固定于改良Franz扩散池的供给池和接受池之间。称取0.5g海桐皮方提取膏加入供给池,累积透皮6小时后取出接收液,经0.22μm滤膜过滤。应用UPLC-Q-TOF-MS方法结合相关数据库分析鉴定海桐皮方提取膏的透皮后的化学成分。结果:通过UPLC-Q-TOF-MS技术对海桐皮方供试液和对照品进行正负离子全扫描,获得正负离子模式下的离子流图。采用UNIFITM 1.9.4.053软件对海桐皮方提取膏的透皮接收液的质谱数据进行分析,并结合质谱片段信息解析和对照品比对,在透皮接收液中共鉴定26种化合物,包括芦丁、羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷等。其中甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芦丁和升麻苷经过对照品比对确认。通过查阅文献,我们确定了这些透皮成分的归属,其中这些活性中,当归9种,川芎6种,红花6种,白芷8种,海桐皮2种,川椒8种,甘草9种,没药1种,防风10种,透骨草1种,威灵仙1种。结论:本节通过Franz扩散池法及UPLC-Q-TOF-MS技术鉴定出海桐皮方提取膏透皮活性成分共26种,并确定了这些透皮成分的归属,为我们下一步的作用机制研究提供药效物质基础。第二节:基于网络药理学探究海桐皮方提取膏治疗KOA的机制目的:基于第一节获得的透皮成分应用网络药理学方法,预测海桐皮方提取膏治疗KOA的潜在作用成分、靶点及通路。方法:以“Knee osteoarthritis(KOA)”为检索词在 Disgenet(https://www.disgenet.org/)和Gene Cards(https://www.genecards.org/)在线数据库中检索得到KOA靶点信息。通过将海桐皮方提取膏透皮成分靶点和KOA靶点相互映射,得到交集靶点,将映射得到的结果导入String数据库,并构建蛋白相互作用网络。将上述得到海桐皮方提取膏透皮成分及相关靶点与KOA疾病靶点导入软件Cytoscape 3.7.2中,构建中药—成分—靶点网络。通过选择生物过程、细胞组成、分子功能、KEGG路径对得到的结果进行GO和KEGG分析。并将结果绘制成柱状图及气泡图,作可视化分析。结果:海桐皮方提取膏透皮成分共涉及相关靶点317种,将其与通过数据库得到的KOA疾病靶点取交集得到交集靶点,共得到142个节点、2047条边。蛋白—蛋白互作网络(PPI)显示:连接值排名前5的靶点分别为ALB,AKT1,EGFR,MMP9,PTGS2。“中药-成分-靶点-通路”网络图中,连接值前5的靶点分别为MAPK1,AKT1,NFKB1,MAP2K1,EGFR。表明这5个靶点有更多的成分和通路与其作用。前20条通路中除去宽泛的通路,与膝骨关节炎有关的通路包括代谢通路、PI3K-AKT通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路等。以上说明具有海桐皮方提取膏多成分、多靶点、多通路作用的特点,其作用机制可能与代谢和炎症相关。结论:本节从整体上预测了海桐皮方提取膏治疗KOA的靶点包括MAPK1,AKT1,NFKB1等,涉及到代谢通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等,其作用机制可能与代谢和炎症相关。此节内容为我们下一节联合代谢组学分析提供上游的靶点和通路。第三节:基于代谢组学并整合网络药理学探究关键靶点和通路目的:应用代谢组学挖掘海桐皮方提取膏干预KOA的差异代谢物和代谢通路,并与上节的网络药理学结果整合分析,探究其共有的靶点和代谢通路。方法:本节中样本共三组:空白组、模型组、海桐皮方提取膏最佳剂量组(高剂量),以膝关节软骨为研究对象,对样本数据进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析,并绘制差异代谢物火山图等,展示各组间代谢物组成的差异。根据统计检验计算P值、VIP和组间差异倍数。当P<0.05和VIP>1时,认为代谢物分子具有统计学意义。筛选获得KOA模型大鼠给药组和模型组的差异代谢物与上一节海桐皮方提取膏治疗KOA的靶点导入MetScape(Cytoscape 3.7.2插件)中,得到“成分-反应-酶-靶点”网络图,并从中得到差异代谢物和网络药理靶点的共同靶点及通路。结果:在正离子模式下鉴定了 9543个化学成分,负离子模式下鉴定了 25427个化学成分。PCA分析中,差异并不显著。应用PLS-DA、OPLS-DA模型区分不同组的差异关系,结果表明该模型可以有效、可靠地应用于潜在生物标志物的预测。空白组、模型组、给药组鉴定得到446个差异代谢物,其中,给药组和模型组鉴定得到26种差异代谢物,其中含量上调代谢物为12种,含量下降代谢物为14种,包括泛酸、前列腺素、柠檬酸、犬尿氨酸、D-赖氨酸、次黄嘌呤等。在代谢组学及网络药理学整合分析中,共有1436个节点,30个大簇。联合分析通路结果和非靶代谢通路结果以及网药KEGG分析结果可知,COX-2和MPO为核心靶点,花生四烯酸代谢和酪氨酸代谢为三者共有通路,有关的透皮成分为山柰酚-3-O-芸香糖苷、E-藁本内酯、芦丁、洋川芎内酯A和茵芋碱。通过结合文献查阅,关键靶点COX-2正是花生四烯酸代谢的关键催化酶,所以我们将作用通路锁定在花生四烯酸代谢通路中的COX-2/PGE2途径上。结论:(1)通过非靶向代谢组学分析,海桐皮方治疗KOA的差异代谢物包含泛酸、柠檬酸、犬尿氨酸、前列腺素、次黄嘌呤等,可能通过调控三羧酸循环、花生四烯酸代谢、核黄素代谢等通路调节大鼠机体代谢紊乱以治疗KOA。(2)联合分析发现海桐皮方提取膏关键作用通路可能是花生四烯酸代谢中COX-2/PGE2途径,通过抑制COX-2水平,减少花生四烯酸转化为PGE2的催化合成,从而发挥抗炎以及镇痛作用。第四节:海桐皮方提取膏治疗KOA关键靶点和代谢通路验证目的:验证海桐皮方提取膏是否通过花生四烯酸代谢通路中的COX-2/PGE2途径干预KOA,并应用分子对接技术验证上节联合分析获得的5种关键透皮成分与核心靶点COX-2和MPO的结合能和作用模式。方法:按照第二部分的动物分组及干预方法,干预4周后采集大鼠关节软骨。qPCR、WB实验检测COX-2 mRNA和蛋白表达量,ELISA法检测了 PGE2的表达情况。应用分子对接技术分析第三节联合分析获得的5个有效透皮活性成分山柰酚-3-O-芸香糖苷、E-藁本内酯、芦丁、洋川芎内酯A和茵芋碱与核心靶点COX-2和MPO的结合能。经过配体处理、受体选择及处理后,使用半柔性对接模式。选择分子对接结合能最低的最佳形式被认为是最稳定的对接模式。选择结合能最低的稳定构象用于可视化模式分析,将其导入Pymol 2.4作图软件构建3D分子结构图。结果:WB法检测COX-2蛋白的表达并进行比较,经造模干预后M组的COX-2蛋白的表达水平明显高于C组。用海桐皮方提取膏干预后,COX-2蛋白表达呈下降趋势,且下降程度与海桐皮方提取膏浓度呈正相关,且LD、MD、HD组均与M组差异有统计学意义(P<0.05)。HD组与V组仍有差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。采用qPCR检测COX-2 mRNA表达情况,发现其与前者蛋白表达一致。ELISA法检测了PGE2的表达情况中,KOA造模后,M组PGE2表达水平明显增高(P<0.05)。用海桐皮方提取膏干预后,PGE2表达呈下降趋势,且下降程度与海桐皮方提取膏浓度呈正相关,且LD、MD、HD组均与M组差异有统计学意义(p<0.05)。HD组与V组仍有差异,V组与C组有差异,差异均具有统计学意义(P<0.05)。分子对接结果显示5种透皮活性成分均与COX-2、MPO以氢键和疏水等相互作用进行结合,显示出有较理想的潜在活性效果。结论:(1)海桐皮方提取膏可通过花生四烯酸代谢通路中COX-2/PGE2途径,抑制COX-2表达,减少PGE2释放,进而减轻KOA炎症及疼痛,延缓疾病进程。(2)山柰酚-3-O-芸香糖苷、E-藁本内酯、芦丁、洋川芎内酯A和茵芋碱可能是海桐皮方提取膏治疗KInfected total joint prostheticsOA的关键有效透皮成分。(3)MPO可能是海桐皮方提取膏治疗KOA的另一个潜在治疗靶点。