研究背景不稳定性心绞痛属于急性冠脉综合征,是由于动脉粥样斑块破裂或糜烂,伴有不同程度血栓形成、血管痉挛和远端血管栓塞所导致的心前区、剑下、胸骨后等部位片状分布的烧灼感、紧缩感,或心绞痛症状持续时间不断延长、进行性增加为典型临床表现。该病西药治疗抗栓、降脂等以预防不良心血管事件的发生;或非药物治疗恢复心肌血运,改善血流灌注。本病属于中医胸痹、卒心痛范畴,心血瘀阻是不稳定性心绞痛的基本病机。活血化瘀药治疗不稳定性心绞痛在缓解临床症状、改善心功能、抗炎、降低不良心血管事件的发生等方面有较好的疗效。注射用血栓通(冻干)成分为三七总皂苷(PNS),具有活血祛瘀,通脉活络的功效,用于瘀血阻络,中风偏瘫,胸痹心痛及视网膜中央静脉阻塞症。本品治疗不稳定性心绞痛在终点指标、改善中医症状体征疗效方面尚缺乏高质量循证证据,且三七总皂苷起效的多成分、多靶点、多通路的分子作用机制尚不明确。为了明确注射用血栓通(冻干)联合阿司匹林、氯吡格雷干预不稳定性心绞痛减少不良心血管事件的循证证据和分子机制,开展多中心、随机、双盲、平行对照临床研究评价,通过网络药理学预测分子机制,筛选炎症指标和血管内皮生长因子,并应用去globin mRNA建库的RNA-seq高通量测序方法进一步确证其抗炎和促血管内皮生长因子表达的分子机制。研究目的通过随机对照研究,对注射用血栓通(冻干)联合阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛减少不良心血管事件进行循证评价,网络药理学结合RNA-seq高通量测序阐释该联合用药方案的多靶点-多通路的分子机制。研究方法1.注射用血栓通(冻干)联合阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛降低主要不良心血管事件循证评价:设计多中心随机双盲平行对照试验,采用中心分层区组随机化方法,以发生主要不良心血管事件(MACE)为效应指标计算样本量,研究组与对照组按照1:1,分别纳入600例符合纳排标准的不稳定性心绞痛心血瘀阻证患者。试验组干预措施为,对照组干预措施为,两组患者分别干预7-14天,结MLN8237分子式束干预后随访6个月。以CCS等级、中医症状体征积分改善情况、心肌损伤标志物变化为次要疗效指标biomedical optics,在干预用药结束后进行评价;以终点指标6个月MACE发生率为主要疗效指标,在随访结束后进行评价;以肝、肾功能、血尿常规和不良事件/不良反应为安全性指标。试验结束数据标准化后,进行意向性分析,并在符合方案数据集(PP集)进行有效性评价,对全人群和预后不良心血管事件高危人群进行疗效评价;在安全集(SS集)进行安全性评价。另外,在治疗期开始和结束时保存患者的血样样本,以备后续进行中心化检测。2.基于网络药理学探索注射用血栓通(冻干)联合阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛的核心靶点和分子作用机制:利用CNKI数据库,检索PNS所含有的化合物成分;通过PubChem数据库和SwissTargetPrediction数据库,预测PNS潜在靶点。不稳定性心绞痛疾病靶点来源于利用Genecards、OMIM、TTD数据库检索不稳定性心绞痛的疾病靶点。使用Venny 2.1映射药物-疾病的交集靶点;使用Cytoscape 3.7.2软件进行“药物-成分-靶点-疾病网络”构建。利用STRING数据库进行交集靶点之间的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络可视化。采用Metascape数据库对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。3.通过酶联免疫双抗检测法测定血清炎症指标、血管内皮生长因子的含量,通过RNA-seq高通量测序、去globin mRNA建库的转录组学方法,探索注射用血栓通(冻干)联合双抗血小板药物干预UA的多靶点-多通路参与炎症反应和促血管内皮生长因子表达的分子机制:从PAXgene Blood RNA Tubes的全血中分离和纯化RNA;去除高峰度的GlobinmRNA进行文库构建和上机测序;数据过滤后使用Dr.Tom多组学数据挖掘系统进行数据分析;使用HISAT2软件与参考基因组比对,使用Bowtie2与参考基因集比对;使用RSEM软件进行基因表达定量,使用DESeq2进行差异基因检测;基于超几何检验,使用Phyper对差异基因进行GO及KEGG富集分析。研究结果1.注射用血栓通(冻干)联合阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛降低主要不良心血管事件的有效性和安全性研究:(1)纳入来自全国16个省、市、直辖市共计1229例(试验组617 vs对照组612),FAS集1109例(试验组556 vs对照组553),PP集1014例(试验组507 vs对照组507),SS群1214例(试验组609 vs对照组605)。(2)基线分析:PP集试验组和对照组受试者男性均明显多于女性;试验组和对照组平均年龄均为62岁,两组人口学资料(性别、年龄、民族、职业、身高、体重、吸烟、饮酒)、疾病史(高血压、糖尿病、高血脂、心肌梗死病史和冠状动脉重建史)和不稳定性心绞痛相关症状体征(TIMI风险评分、NYHA心功能分级、冠脉狭窄、24小时心绞痛发作、心电图等),试验组和对照组均无统计学差异(P>0.05),基线具有可比性。FAS集基线分析与PP集分析结果一致,具有可比性。(3)疗效分析:①试验组终点指标MACE发生率低于对照组(5.92%vs 3.16%)两组MACE发生率比较有统计学差异(P<0.05),试验组MACE发生率相对于对照组MACE发生率减少46.67%;试验组MACE发病时间为27.88 d,对照组MACE发病时间为19.60 d。②基线两组心绞痛CCS等级分布卡方检验无统计学差异(P>0.05)具有可比性;干预结束后两组CCS等级均呈现下降趋势,试验组CCS改善率高于对照组,卡方检验无统计学意义(52.07%vs49.11%,P>0.05)。③基线两组中医症状体征总积分具有可比性(试验组3.77±1.25 vs对照组3.76±1.26,P>0.05);干预结束后试验组、对照组治疗后中医症状总积Bemcentinib说明书分均呈下降趋势,试验组总积分下降2.48±1.37分,对照组下降2.41±1.37,较治疗前均有统计学差异;试验组总积分下降率与对照组相差不大(67.147±32.251%vs66.572±34.194%),两组间比较无统计学差异。④基线两组胸痛积分具有可比性(1.533±0.559vs 1.513±0.556,P>0.05),治疗后两组胸痛积分均呈下降趋势,各组组内比较均有统计学差异;两组间积分下降的差值和下降率比较,均无统计学差异。两组改善率均高于80%,组间比较无统计学差异。其余兼证胸闷、心悸、乏力、面色晦暗的比较结果与主症胸痛组间比较结果相同。⑤心肌损伤指标CK-MB、cTnT变化相对值百分比进行分析,试验组CK-MB指标用药后相对值变化百分比优于对照组,组间比较无统计学差异(P值>0.05),试验组cTnT指标相对值变化百分比优于对照组,组间比较有统计学意义(P值<0.05)。⑥以TIMI高危因素进对CCS改善、中医证候体征及改善情况进行亚组分析显示,试验组TIMI危险因素高危受试者用药后CCS改善情况改善率显著高于对照组(76.67%vs 51.52%,P<0.05)差异有统计学意义;中医证候体征变化情况:中医证候体征总积分的绝对变化、相对变化以及改善率,试验组均优于对照组,有显著性差异;胸痛的中医证候体征总积分的绝对变化、相对变化以及改善率,试验组均优于对照组,有显著性差异。其余兼症胸闷、心悸、乏力、面色晦暗的组间消失率比较,试验组均优于对照组,有显著性差异。⑦安全性分析:有37例受试者发生了 AE(试验组17 vs对照组20例),累计ADR/AE表现46例次(试验组20例次vs对照组26例次)。试验组ADR/AE发生率为 3.28%(20/609),对照组 ADR/AE 发生率为 4.30%(26/605)。2.基于网络药理学探索注射用血栓通(冻干)联合阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛的核心靶点和分子作用机制:(1)PNS获得了 26个化合物成分,不稳定性心绞痛筛选到71个靶点;(2)联合用药方案核心靶点PPI网络聚类分析获得4个聚类,共计13个核心靶点。核心靶点为AKT1、VEGFA、CASP3、EGFR、MMP9、PPARG、HIF1A、PTGS2、MAPK1、CYP2D6、STAT3、HRAS、ITGB3;(3)Go富集显示有20个生物学过程有显著性;KEGG Pathway富集通过调控NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路等发挥活血化瘀作用。3.ELISA血清学指标检测结果:(1)试验组和对照组从4家保留患者治疗前、后血液样本的临床单位中随机纳入TIMI中高危患者各40例,两组患者人口学资料、基础疾病等基线信息具有可比性。(2)炎症指标检测结果显示,注射用血栓通(冻干)联合双抗血小板药物治疗不稳定性心绞痛患者,连续干预7-14天后,能降低炎症指标血清hs-CRP、IL-6、MMP-9、HMGB1的含量,各炎症指标组内比较均有统计学差异;对各指标的变化的绝对变化(下降的差值)和相对变化(变化率)进行组间比较,试验组hs-CRP、IL-6、MMP-9、HMGB1的绝对变化显著高于对照组,差异有统计学意义;试验组hs-CRP、IL-6、MMP-9、HMGB1的相对变化也显著高于对照组,差异有统计学意义。(3)VEGF检测结果显示,注射用血栓通(冻干)联合双抗血小板药物治疗不稳定性心绞痛患者,连续干预7-14天后,能上调VEGF的表达,上调趋势明显,试验组VEGF绝对变化(差值变化)和相对变化(变化率)显著高于对照组,差异有统计学意义。4.RNA-seq高通量测序、去globin mRNA建库的mRNA测序结果:(1)最终对78例进行检测和分析,样品比对基因组、基因集的平均比对率较高,Clean Reads Q20均≥97.87%,样品间的数据量比较稳定,无较大差别,总体测序质量较好;(2)GO富集分类显示,注射用血栓通主要参与了细胞过程、应激反应、免疫调节、细胞黏附、细胞增殖迁移等生物学过程;(3)试验组干预前后比较,KEGG信号通路富集差异通路提示,PNS治疗不稳定性心绞痛参与调控MAPK信号通路、PI3K-ART信号通路、钙离子信号通道等。试验组和对照组治疗后比较,KEGG信号通路富集差异通路提示,PNS联合阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛参与调控NF-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K-ART信号通路等。结论1.注射用血栓通(冻干)联合阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛心血瘀阻证6个月不良心血管事件发生率为3.16%,较对照组MACE发生率减少46.67%;能缓解心绞痛,改善心血瘀阻的中医症状体征,尤其对不稳定性心绞痛预后不良心血管事件高危人群(TIMI评分5～7分)的心绞痛和心血瘀阻证改善的疗效显著优于阿司匹林联合氯吡格雷治疗。2.注射用血栓通(冻干)联用阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛具有多成分、多靶点、多通路的作用特征。3.注射用血栓通(冻干)联用阿司匹林、氯吡格雷治疗不稳定性心绞痛可能通过调控NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路等,下调hs-CRP、MMP-9、IL-6、HMGB1的表达,上调VEGF的表达,减轻炎症反应,改善血管内皮功能。