透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是肾癌中最常见的组织学亚型。根治性肾切除术则是局限性肾透明细胞癌的主要治疗方式。然而据报道,每年仍有许多肾癌患者死于癌症的转移与复发。尽管目前已有多种靶向药物相继问世,但其治疗效果同样有限。因此我们针对ccRCC的研究仍需进行。肾透明细胞癌是一种免疫原性肿瘤。其肿瘤微环境中存在着大量的免疫细胞。其中由肿瘤抗原的呈递所募集的T细胞则会诱使抗肿瘤免疫反应的发生。然而免疫细胞表面的免疫检查点却可抑制抗肿瘤免疫并促进癌症进展。基于这一特点,免疫检查点抑制治疗应运而生,并成为ccRCC的主要治疗方式之一。然而,ccRCC也是一种高度异质性的肿瘤。其复杂的免疫微环境为免疫逃逸的发生提供了许多机会。这也导致了 ccRCC对免疫治疗的反应各异。因此,研究ccRCC免疫微环境的特征以及发现更多能够影响或反映肿瘤免疫的分子变得更加重要。细胞死亡是机体稳态调节的一种重要的生物学过程。生物体内每天都会有大量的细胞发生死亡。而这种生物学过程同样也广泛发生在炎症和肿瘤当中,并在其中发挥着不容忽视的作用。不同于细胞坏死,程序性细胞死亡是一种可受调控的主动的细胞死亡形式。随着研究的进展,越来越多的程序性细胞死亡类型逐渐被人们发现,其中就包括细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡、铁死亡和泛凋亡等。这些细胞死亡类型均有着其各自的分子机制及形态学特点。其中的泛凋亡就是一种新定义的强免疫原性的程序性细胞死亡类型。泛凋亡的发生涉及到细胞凋亡、焦亡和坏死性凋亡这三种细胞死亡形式的相互串扰与共同激活。目前针对泛凋亡及其相关生物分子的研究主要集中在感染性疾病和自身免疫性疾病上,而其在肿瘤中的作用,尤其是在被定义为免疫原性肿瘤的肾透明细胞癌中的作用仍不清楚。本研究旨在探寻泛凋亡相关的长链非编码RNA(lncRNA)在ccRCC中的临床和生物学价值。我们blood biochemical首先从与泛凋亡密切关联的三种程序性细胞死亡入手,分别探究这三种细胞死亡相关lncRNA在ccRCC中的作用。之后我们进一步挖掘了泛凋亡相关lncRNA在ccRCC中的临床价值。最后我们挑选了一个最具代表性的泛凋亡相关lncRNA并探讨了其在ccRCC中的生物学特性。总体上我们的研究可以分为以下三个部分:第一部分细胞凋亡/焦亡/坏死性凋亡相关的lncRNA与ccRCC进展、预后及免疫浸润的相关性的探索。目的:分别探讨凋亡相关lncRNA、焦亡相关lncRNA以及坏死性凋亡相关lncRNA与肾透明细胞癌进展、预后及免疫浸润之间的相关性。方法:1.我们从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中获得611例ccRCC患者样本的基因表达数据与临床数据。2.从先前的研究中分别获得细胞凋亡、焦亡以及坏死性凋亡相关基因并探索这些基因在ccRCC样本中的表达情况。3.通过相关性分析分别获得与这三种细胞死亡类型显著相关的lncRNA并通过单因素COX回归分析筛选出其中具有显著预后价值的lncRNA。4.分别基于这三种细胞死亡相关lncRNA对ccRCC样本进行一致性聚类,并探寻不同聚类间ccRCC的临床病理因素以及预后的差异。5.进一步探讨不同聚类之间肿瘤免疫微环境评分、免疫检查点基因表达以及免疫细胞浸润水平的差异。结果:1.通过分析我们共获得了具有显著预后价值的细胞凋亡相关lncRNA、焦亡相关lncRNA以及坏死性凋亡相关lncRNA分别有54个、147个和39个。2.聚类分析的结果显示三种聚类方式所获得的聚类之间,ccRCC患者的生存率和临床分期均存在显著差异。3.不同聚类之间,六种常见免疫检查点基因的表达均存在显著差异。4.不同聚类之间,免疫细胞的浸润水平及肿瘤微环境的免疫评分均存在显著差异。小结:细胞凋亡/焦亡/坏死性凋亡相关lncRNA与ccRCC的进展和预后有关;细胞凋亡/焦亡/坏死性凋亡相关lncRNA与ccRCC的免疫细胞浸润和免疫微环境有关。第二部分免疫相关泛凋亡(细胞凋亡、焦亡及坏死性凋亡)lncRNA在ccRCC中作用的综合分析目的:综合分析免疫相关泛凋亡lncRNA在ccRCC中的作用并构建一个新的免疫相关泛凋亡lncRNA风险模型。方法:1.通过相关性分析获得与凋亡基因、焦亡基因和坏死性凋亡基因均显著相关的基因(泛凋亡相关基因)。2.我们将表达模式相似的泛凋亡相关基因聚类为不同的基因模块。随后我们探寻这些基因模块与各种免疫细胞浸润之间的相关性并选取其中一个基因模块用于后续分析。3.从选取的模块基因中提取lncRNA(免疫相关泛凋亡lncRNA),并通过单因素COX回归分析进一步筛选其中最具预后价值的lncRNA。4.根据获得的lncRNA进行一致性聚类并分析不同聚类间患者预后、临床病理参数、功能富集和肿瘤免疫的差异。5.使用Lasso回归分析构建一个基于免疫相关泛凋亡lncRNA的风险模型。6.分析比较不同风险ccRCC样本间功能富集和免疫浸润的差异。7.分析比较不同风险ccRCC样本间免疫疗效及药物敏感性的差异。8.收集www.selleck.cn/products/gdc-0068临床中行手术治疗的ccRCC患者60例,利用qRT-PCR检测模型相关lncRNA的表达水平并根据模型公式计算每个患者的风险评分,分析不同风险评分患者的临床特征及预后差异。结果:1.免疫共表达网络分析的结果显示泛凋亡相关的基因模块与各种免疫细胞浸润之间存在着或强或弱的关联。2.筛选出的预后免疫相关的泛凋亡lncRNA均在ccRCC肿瘤组织中高表达,并与较差的预后有关。3.一致性聚类分析结果显示,不同聚类间ccRCC的病理分级、临床分期以及总生存率均存在显著差异。聚类间的差异主要与细胞因子活性、T细胞受体信号通路、抗原处理和呈递等免疫相关功能和信号通路有关。相比于聚类1,聚类2中样本的免疫细胞浸润水平更高,肿瘤纯度更低,免疫检查点基因和抗原呈递相关基因的表达也更高。4.我们基于5个免疫相关泛凋亡lncRNA构建一个全新的风险模型。该模型能够很好的将ccRCC患者分为临床预后显著不同的两组并具有较高的预测准确性。单因素和多因素COX回归分析结果表明通过该模型所计算的风险评分是ccRCC的独立预后因素。结合另外两个独立预后因素,我们构建了一个可预测患者生存率并具有较好预测效能的列线图。此外,主成分分析及生存分析表明我们的风险模型具有良好的样本划分能力以及适用性。在临床肾癌患者队列中对该模型的验证则证明了该风险模型的临床应用价值。5.肾癌患者的风险评分与肿瘤微环境的免疫细胞浸润,免疫相关功能的富集以及免疫相关通路的广泛激活显著相关。6.高风险的ccRCC样本的免疫检查点基因的表达以及TCIA评分也更高。此外。我们还获得了几种适合不同风险分层患者的治疗药物。小结:免疫相关泛凋亡lncRNA与ccRCC的进展、预后、微环境免疫浸润、抗原呈递以及免疫治疗反应有关;我们基于免疫相关泛凋亡lncRNA构建了一个可以用于预测ccRCC患者预后和评估免疫治疗疗效的风险模型。第三部分免疫相关泛凋亡lncRNA LINC00944的生物学价值的探索目的:探索免疫相关泛凋亡lncRNA LINC00944在ccRCC中的生物学价值。方法:1.我们首先分析了 LINC00944在611个TCGA-ccRCC肿瘤样本和正常样本中的表达差异。之后我们通过qRT-PCR检测了 LINC00944在ccRCC临床样本及细胞系中的表达。2.我们在TCGA患者队列和收集到的60例临床样本中探索了 LINC00944表达与各种临床病理特征的相关性。3.我们在TCGA队列及临床样本中探索了 LINC00944的预后及临床诊断价值。4.我们通过划痕实验和Transwell实验检测LINC00944过表达和敲低后肾癌细胞系迁移和侵袭能力的变化。5.通过富集分析获得LINC00944相关信号通路。通过western blot实验检测LINC00944过表达和敲低后JAK-STAT通路蛋白的表达变化。6.利用JAK通路抑制剂AG490抑制JAK-STAT通路活性。利用western blot检测AG490干扰LINC00944调控JAK通路的情况。设计功能回复实验,验证LINC00944是否可通过JAK-STAT通路影响ccRCC的迁移和侵袭。7.进行基因集富集分析和免疫相关性分析。分析LINC00944表达与免疫细胞浸润、免疫评分、免疫检查点基因表达、抗原呈递基因表达以及TCIA评分的相关性。8.在单细胞水平探索LINC00944的表达特点,通过免疫组化验证LINC00944与T细胞浸润的相关性。结果:1.LINC00944在ccRCC肿瘤组织和细胞中均显著高表达。2.在TCGA患者队列中,LINC00944的高表达与患者的年龄更大,临床分期更晚以及病理分级更高显著相关。在60例临床病例中,LINC00944的高表达与患者的T分期和M分期更晚显著相关。3.在TCGA患者队列中,LINC00944高表达的患者的总生存率和无进展生存率更差,且LINC00944具有很高的临床诊断价值。在60例临床病例中,LINC00944高表达的患者的总生存率更低,然而差异却并无显著性。LINC00944同样表现出很高的诊断价值。4.过表达LINC00944可促进肾癌细胞的迁移和侵袭,而敲低LINC00944则可抑制肾癌细胞的迁移和侵袭。5.通路富集分析显示LINC00944与JAK-STAT通路激活有关。western blot结果显示敲低LINC00944后p-JAK和p-STAT3蛋白表达降低,而过表达LINC00944后p-JAK和p-STAT3蛋白表达增加。6.过表达LINC00944增加了 p-STAT3蛋白表达,而加入AG490后则逆转了 LINC00944对p-STAT3蛋白表达的调控。过表达LINC00944增加了肾癌细胞的迁移和侵袭能力,而加入AG490后则部分挽回了 LINC00944对肾癌细胞迁移和侵袭的影响。7.免疫相关性分析的结果表明LINC00944的表达与T细胞浸润有关。LINC00944高表达的肾癌样本的“肿瘤内异质性”和“CTA评分”等免疫评分以及TCIA评分更高。LINC00944表达与抗原呈递基因和免疫检查点基因的表达显著正相关。8.单细胞分析表明LINC00944在上皮细胞和T细胞中显著高表达。LINC00944在肿瘤上皮细胞中的表达显著高于正常上皮细胞。LINC00944高表达的上皮细胞的凋亡/焦亡/坏死性凋亡基因集富集评分也普遍更高。细胞通讯分析的结果显示T细胞主要接受来自上皮细胞和内皮细胞的信号。上皮细胞与T细胞间相互作用的主要信号通路为MIF信号通路。免疫组化结果显示LINC00944高表达的ccRCC临床标本中的T细胞阳性率更高。小结:LINC00944在ccRCC组织和细胞中显著高表达;LINC00944与ccRCC的进展和预后有关,并具有很高的诊断价值;LINC00944可通过JAK-STAT通路影响肾癌细胞的迁移和侵袭;LINC00944的表达与ccRCC患者对免疫治疗的反应有关;LINC00944表达与ccRCC微环境中T细胞的浸润显著相关。结论:1.细胞凋亡/焦亡/坏死性凋亡相关lncRNA与ccRCC的进展、预后和微环境免疫浸润有关。2.免疫相关泛凋亡(凋亡、焦亡、坏死性凋亡)lncRNA与ccRCC的进展、预后、免疫细胞浸润和免疫治疗反应显著相关。3.基于免疫相关泛凋亡lncRNA构建了一个新的风险模型。4.LINC00944在ccRCC组织和细胞中显著高表达并与ccRCC的进展有关。LINC00944具有重要的预后和临床诊断Lorlatinib生产商价值。5.高表达的LINC00944可促进ccRCC细胞的迁移和侵袭;敲低LINC00944则可抑制ccRCC细胞的迁移和侵袭。6.LINC00944可通过调节JAK-STAT通路活性影响ccRCC细胞的侵袭和迁移。7.LINC00944与ccRCC患者对免疫治疗的反应有关。LINC00944的高表达与ccRCC微环境中T细胞的高度浸润显著相关。