副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是常见的重要食源性致病菌,产生耐热溶血素(Thermostable direct hemolysin)和耐热相关溶血素(TDH-related hemolysin)是该菌具有危害性判定和食品安全检测最重要的依据。由于近年来我们在临床分离的菌株中检测出不携带tdh/trh两个基因,同时,从水产品和环境中分离出的菌株约60%是不携带tdh/trh两个基因,仍然可能具有致病性,从而导致食品安全事件发生,所以挖掘并解析新的毒力因子的功能和阐点击此处明危害形成机制成为了当下迫切需要解决的问题。本论文针对目前水产品来源的副溶血性弧菌在不携带tdh/trh的情况下,是否具有致病性的问题展开PUN30119细胞培养了研究,首先基于前期分离的菌种库,利用PCR方法对tdh~-/trh~-副溶血性弧菌进行基因分型,通过细胞实验和动物实验进行毒力差异菌株的筛选,确定了高毒力菌株;然后为了阐明tdh~-/trh~-高毒力菌株的危害形成原因,对其进行了全基因测序和比较基因组分析,明确其遗传特征,结合菌株感染细胞的转录组特征,确定了相关差异基因;为了揭示tdh~-/trh~-菌株的危害形成机制,通过基因定点敲除与回补解析了相关毒力因子的功能,并通过权重共表达网络分析了相关致病因子的调控机制;为了进一步解析相关毒力因子的调控机制,通过蛋白组学方法对相关基因突变体及野生型的差异表达蛋白进行分析,阐明了相关毒力因子在蛋白水平的作用机制;最后为了探究tdh~-/trh~-菌株在体内的作用机制,构建了tdh~-/trh~-副溶血性弧菌感染小鼠模型并初步探究了相关致病机制,同时,针对tdh~-/trh~-菌株感染的防控,应用本实验室选育的具有拮抗多种食源性致病菌的活性益生菌戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)进行了防控效果的评价。主要研究内容和结果如下:(1)高毒力tdh~-/trh~-副溶血性弧菌VP353的筛选及组学特征研究通过细胞实验和动物实验,从本实验室前期建立的水产品副溶血性弧菌菌种库中筛选出一株tdh~-/trh~-高毒力菌株VP353。通过全基因组测序,VP353全长5.28 Mb,由2条染色体组成,1号染色体由3.30 Mb和2952个预测ORF组成,2号染色体由1.98 Mb和1772个预测ORF组成;通过VFDB数据库,发现tdh~-/trh~-副溶血性弧菌高毒力株VP353同时携带新的毒力基因hly A、hly B、hly C和hly D,其蛋白亲缘关系与大肠杆菌最相近;通过比较基因组对VP353进行了T3SS基因簇的比较分析,发现VP353与标准菌株相比,T3SS1基因簇相似度均在99%以上,而T3SS2基因簇相似度只有66%以上;通过VP353感染Caco-2细胞前后转录组分析,发现一共有958个基因发生了上调,主要富集在有机氮化合物的生物合成和代谢过程,其中与毒力相关的MSHA IV型菌毛、鞭毛、群体感应基因(Cqs A、Lux S)、胞外多糖T2SS相关基因和hly A、hly C基因发生显著上调。(2)基于转录组的tdh~-/trh~-副溶血性弧菌VP353毒力基因Qrr5调控机制基于VP353感染宿主的转录本进行筛选,以Qrr5作为新型毒力因子进行了研究,通过基因敲除及基因回补表达方法,成功构建了副溶血性弧菌△Qrr5突变体及△Qrr5::Qrr5回补菌株;经过相关表型测定,发现△Qrr5突变体的细胞毒性、细胞粘附力及生物被膜的形成能力与野生型相比,都显著降低,表明Qrr5对毒力具有正调控作用;通过△Qrr5突变体及野生型感染宿主的转录组测序,发现分别在感染宿主0、2、4和6h分别改变了185、586、3prophylactic antibiotics55和74个显著差异表达基因,Qrr5基因缺失在感染宿主前期和后期显著影响了T3SS1基因簇的表达;基于△Qrr5突变体及野生型感染宿主的转录本分析,构建了Qrr5在感染宿主过程中的基因调控网络,一共有17个基因,其中VP2914、VP0485、VP2492和VP1665基因表现出强相关,并对其表达量进行了q RT-PCR的验证,结果基本一致。(3)基于蛋白组的tdh~-/trh~-副溶血性弧菌VP353毒力基因Qrr5调控机制通过蛋白组定量分析,发现△Qrr5突变株和野生型一共鉴定出297个显著差异表达的蛋白,其中有137个蛋白上调,160个蛋白下调;通过GO和KEGG对差异蛋白进行富集分析,发现上调的蛋白主要富集在氧化还原酶活性、硫代谢和ABC转运蛋白途径,下调蛋白主要富集在胞内信号转导、双组分系统和氨基酸生物合成途径;通过蛋白结构域的预测进行富集分析,发现上调蛋白主要富集在Na~+/H~+转运蛋白、C端Nha C样和转录调节因子HTH、Lys R结构域中,下调蛋白的主要富集结构域是翼状螺旋样DNA结合结构域超家族和Deo R型HTH结构域;通过对差异蛋白进行筛选和相关表型测定,发现Qrr5可能参与了调控因子Lys R家族蛋白、Omp A家族蛋白和接合转移蛋白Tra A的调控来抑制自凝集形成能力和对大肠杆菌的竞争力。(4)高毒力tdh~-/trh~-副溶血性弧菌VP353感染小鼠模型构建及防控研究通过构建tdh~-/trh~-副溶血性弧菌感染小鼠模型,发现TDNH感染组小鼠的存活率显著低于对照组,TDNH感染组小鼠结肠长度显著缩短,且组织中观察到明显的萎缩和损伤;通过对感染组小鼠血清的指标测定,发现TDNH感染组小鼠血清中IL-1β、IL-6水平与对照组相比显著升高,TDPH组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-10水平显著升高。通过对不同感染组小鼠肠道菌群的测定,发现TDNH感染组显著降低了Roseburia,Faecalibaculum等菌群的丰度,显著升高了Eubacterium fissicatena,Erysipelatoclostridium等菌群丰度。应用本实验室选育的具有广泛拮抗多重食源性致病菌的活性益生菌戊糖片球菌IM96干预TDNH感染来进行防控效果评价,发现IM96干预组可以显著提高TDNH组小鼠的存活率,恢复感染带来的肠道损伤,显著降低TDNH组小鼠血清IL-1β、IL-6炎症因子水平,当戊糖片球菌IM96干预后,可以显著降低TDNH组Eubacterium coprostanoligenes,Clostridia vadin BB60,Marvinbryantia等菌群的丰度水平,而显著升高Romboutsia,Turicibacter,Parvibacter等菌群的丰度水平,表明IM96对于tdh~-/trh~-副溶血性弧菌感染具有良好的保护作用。综上,本论文系统研究了tdh~-/trh~-副溶血性弧菌危害形成机制,为副溶血性弧菌的检测和防控研究提供了新思路和新方法,对保障食品安全、促进水产相关食品产业可持续发展具有重大的意义。