目的1.制备尿酸所致人肾小管上皮细胞(Human renal tubular epithelial cells,HK-2)损害模型。2.通过观察HK-2细胞抑制率和转化生长Cobimetinib因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、B-细胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的变化,探讨氯沙坦对尿酸所致HK-2损害是否具有保护作用,及其保护作用是否随氯沙坦浓度增加而增强。方法以HK-2为研究对象。1.制备尿酸所致HK-2损害模型并筛选实验所需氯沙坦浓度。分组:(1)空白组(加入完全培养基,无HK-2);(2)对照组(加入完全培养基);(3)尿酸A组(完全培养基中尿酸浓度为400umol/L);(4)尿酸B组(完全培养基中尿酸浓度为800umol/L);(5)尿酸C组(完全培养基中尿酸浓度为1600umol/L);(6)氯沙坦A组(完全培养基中氯沙坦浓度为1ng/ml);(7)氯沙坦B组(完全培养基中氯沙坦浓度为10ng/ml);(8)氯沙坦C组(完全培养基中氯沙坦浓度为100ng/ml);(9)氯沙坦D组(完全培养基中氯沙坦浓度为1000ng/ml)。每组设置6个复孔,实验重复3次取平均值。各组分别检测24h、48h、72h的细胞抑制率,用CCK8筛选药物浓度及作用时间。2.根据以上实验结果,选择尿酸浓度为800umol/L,氯沙坦浓度为1ng/ml、10ng/ml、100 ng/ml,细胞处理时间为48h,设置新的实验分组:(1)A组(尿酸组,完全培养基中尿酸浓度为800umol/L、氯沙坦浓度为0ng/ml);(2)B组(尿酸+氯沙坦1组,完全培养基中尿酸Biomphalaria alexandrina浓度为800umol/L、氯沙坦浓度为1ng/ml);(3)C组(尿酸+氯沙坦2组,完全培养基中尿酸浓度为800umol/L、氯沙坦浓度为10ng/ml);(4)D组(尿酸+氯沙坦3组,完全培养基中尿酸浓度为800umol/L、氯沙坦浓度为100ng/ml);(5)E组(对照组,完全培养基中尿酸浓度为0umol/L、氯沙坦浓度为0ng/ml)。CCK8实验每组设置6个复孔,实验重复3次取平均值检测各组细胞抑制率,PCR实验每组设置3个复孔,实验重复3次取平均值检测HK-2内TGF-β1和Bcl-2的表达。结果1.不同作用时间及不同浓度尿酸、氯沙坦处理的HK-2中,当尿酸浓度为400umol/L时,与对照组相比,HK-2在24h、48h、72h与对照组相比受到轻度抑制,差异有统计学意义(P<0.05);当尿酸浓度为1600umol/L时,HK-2与对照组相比在24h即受到明显抑制,72h细胞抑制率最高达93.78%;当尿酸浓度为800umol/L、作用时间为48h时,细胞抑制率最接近且不高于50%,因此选择该浓度及时间制备尿酸所致HK-2损害模型。氯沙坦在浓度为1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml,作用时间为24h、48h、72h时,细胞与对照组相比未见明显抑制改变,差异无统计学意义(P>0.05);当氯沙坦浓度为1000ng/ml时,在24h、48h和72h与对照组相比均有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05),72h细胞抑制率最高达96.73%,因此在实验中排除此浓度。2.当HK-2在不同尿酸浓度条件下作用24h、48h、72h时,整体分析(双因素重复测量方差分析)发现,时间比较、浓度比较及时间与浓度的交互作用均有显著性意义(P<0.05),提示细胞抑制率在时间、尿酸浓度的变化很大,且随浓度的变化受时间影响。组间比较(单因素方差分析+多重比较):不同浓度尿酸处理后的各个时间处,3组的差异显著(P<0.05),随着尿酸浓度增加细胞抑制率也从低到高变化。组内比较(配对t检验):3组尿酸浓度所有时间点均有统计学意义(P<0.05),且细胞抑制率随着时间的增加而增加。3.同一浓度尿酸、不同浓度氯沙坦处理HK-2,在48h、尿酸浓度800umol/L的条件下细胞受到明显抑制,细胞在450nm处的吸光度随氯沙坦浓度的升高而升高、细胞抑制率随氯沙坦浓度的升高而降低,差异有统计学意义(P<0.05)。1ng/ml浓度的氯沙坦即可改善尿酸所致的HK-2细胞抑制情况,且细胞抑制改善效果在一定范围内随氯沙坦浓度的升高而升高。4.在48h、尿酸浓度800umol/L的条件下细胞内TGF-β1相对表达量较高、Bcl-2相对表达量较低。随着尿酸中氯沙坦浓度的升高,TGF-β1的相对表达量随之下降,而Bcl-2的相对表达量随之升高,差异有统计学AZD1152-HQPA意义(P<0.05)。低浓度氯沙坦即可改善尿酸引起的HK-2纤维化及凋亡,且这种改善作用在一定范围内随着氯沙坦浓度的升高而增强。结论1.当尿酸浓度为800umol/L、作用时间为48h时,细胞抑制率接近50%,可选择该浓度及时间制备尿酸所致HK-2损害模型。2.细胞抑制率随时间、尿酸浓度的变化很大,且随浓度的变化受时间影响。3.低浓度的氯沙坦即可改善尿酸所致的HK-2细胞抑制及纤维化和凋亡,且改善效果在一定范围内随氯沙坦浓度变化。