目的:雷公藤甲素为中药雷公藤的主要活性成分,具有显著的抗炎和抗肿瘤作用,同时也是雷公藤的主要毒性成分。雷公藤甲素毒性高,毒性范围广,尤其心脏毒性最为显著,这极大的限制了其临床开发应用。因此,降低雷公藤甲素的毒性是目前的研究热点。线粒体损伤是雷公藤甲素心脏毒性的主要特点,“线粒体治疗”有望成为应对雷公藤甲素心脏毒性的重要策略。PGC-1α/NRF1信号调节线粒体生物发生和能量代谢,参与多种心脏疾病的发生。经文献调研发现,黄芪与雷公藤在中医临床应用中配伍频次最多,是中药“配伍减毒”理论中“扶正制毒”的代表,这提示黄芪中可能含有雷公藤甲素减毒的有效成分。本研究旨在发现黄芪抑制雷公藤甲素心脏毒性的活性成分,并围绕PGC-1α/NRF1信号调控的线粒体生物发生,阐明活性成分保护线粒体,降低雷公藤甲素心脏毒性的作用与分子机制。方法:第一部分:筛选高效抑制雷公藤甲素H9C2心肌细胞毒性的黄芪活性成分采用CCK-8法检测不同浓度雷公藤甲素抑制H9C2心肌细胞活力的作用,建立H9C2心肌细胞毒性模型。分别检测黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素和黄芪多糖对H9C2心肌细胞活力的影响,确定各受试药物的安全浓度。在H9C2心肌细胞毒性模型上,检测各受试药物抑制雷公藤甲素H9C2心肌细胞毒性的作用,筛选出高效的黄芪活性成分。第二部分:毛蕊异黄酮抑制雷公藤甲素诱导的心脏毒性通过LDH释放实验,进一步研究毛蕊异黄酮体外抑制雷公藤甲素诱导的心肌细胞毒性。流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中凋亡蛋白cleaved caspase3和caspase 3的表达,研究毛蕊异黄酮抑制雷公藤甲素诱导的H9C2心肌细胞凋亡。倒置显微镜观察H9C2心肌细胞形态,高内涵技术观察细胞微丝,计算F:actin/G:actin,来研究毛蕊异黄酮对H9C2心肌细胞形态和骨架损伤的保护作用。在雷公藤甲素诱导的小鼠心脏毒性模型中,采用Elisa法检测毛蕊异黄酮对心脏损伤相关指标AST、LDH、CK-MB和c TnⅠ血清含量的影响。HE染色法检测毛蕊异黄酮改善小鼠心脏病理损伤的作用。小动物高频心脏超声仪检测毛蕊异黄酮改善心脏收缩功能的作用。第三部分:雷公藤甲素抑制心肌细胞线粒体生物发生雷公藤甲素不同浓度损伤H9C2心肌细胞,采用RT-PCR和Western blot法检测心肌细胞线粒体呼吸链复合体亚单位ATP5A(complexⅤ)、UQCRC2(complexⅢ)、SDHB(complexⅡ)和NDUFB8(complexⅠ)的表达;PCR法检测mt DNA拷贝数;RT-PCR和Western blot法检测线粒体转录因子A(TFAM)获悉更多的表达;流式细胞仪检测心肌细胞线粒体膜电位;化学发光法检测ATP生成。通过以上指标研究雷公藤甲素抑制心肌细胞线粒体生物发生。第四部分:毛蕊异黄酮改善雷公藤甲素诱导的线粒体生物发生障碍在雷公藤甲素建立的H9C2心肌细胞毒性模型上,检测毛蕊异黄酮对线粒体呼吸链复合体亚单位表达,对mt DNA拷贝数,对TFAM表达,对线粒体膜电位,以及对ATP生成的影响。Seahorse生物能仪检测毛蕊异黄酮对H9C2心肌细胞耗氧率的影响。以Mito-tracker和TOM20作为线粒体标记,激光共聚焦显微镜观察H9C2心肌细胞线粒体形态和数量,结合Western blot法检测心肌细胞TOM20表达,研究毛蕊异黄酮体外抑制雷公藤甲素诱导的心肌细胞线粒体数量减少。在雷公藤甲素诱导的小鼠心脏毒性模型上,检测毛蕊异黄酮对线粒体呼吸链复合体亚单位表达,对TOM20蛋白表达,对ATP生成的影响。采用透射电子显微镜观察心脏组织线粒体超微结构,研究毛蕊异黄酮改善雷公藤甲素诱导的线粒体结构损伤。第五部分:毛蕊异黄酮改善心肌细胞线粒体生物发生的机制雷公藤甲素单独或与毛蕊异黄酮同时处理H9C2心肌细胞后,采用RT-PCR法和Western blot法检测细胞中PGC-1α蛋白和m RNA表达;采用Western blot法和免疫荧光法检测细胞核和细胞质的PGC-1α蛋白,来研究雷公藤甲素和毛蕊异黄酮对PGC-1α胞内分布的影响。在小鼠心脏毒性模型上,采用Western blot法检测心脏组织PGC-1α蛋白表达。在H9C2心肌细胞毒性模型上,采用Western blot法检测毛蕊异黄酮对AMPK和p-AMPK表达的影响,采用Western blot法和免疫荧光法检测对SIRT1蛋白表达的影响,以及对NAD~+/NADH的影响,综合判断毛蕊异黄酮增加的PGC-1α细胞核分布,是受SIRT1信号调节,而并非由AMPK信号调节。采用免疫沉淀法检测毛蕊异黄酮对PGC-1α蛋白乙酰化的影响。使用PGC-1α蛋白抑制剂SR18292,比较毛蕊异黄酮对线粒体呼吸链复合体亚单位表达,对mt DNA拷贝数和ATP生成的影响,反向验证PGC-1α去乙酰化在毛蕊异黄酮促进心肌细胞线粒体生物发生中的关键作用。从而表明,毛蕊异黄酮通过增加PGC-1α去乙酰化,促进线粒体生物发生。雷公藤甲素单独或与毛蕊异黄酮同时处理H9C2心肌细胞,采用RT-PCR法和Western blot法检测细胞中NRF1 m RNA和蛋白表达,采用Western blot法和免疫荧光法检测细胞核和细胞质中NRF1。在小鼠心脏毒性模型上,采用Western blot法检测心脏组织中NRF1蛋白的表达。采用细胞转染技术,建立H9C2心肌细胞NRF1基因沉默模型。比较NRF1基因沉默前后,毛蕊异黄酮对线粒体呼吸链复合体亚单位表达和ATP生成的影响。以此反向验证,NRF1蛋白是毛蕊异黄酮促进心肌细胞线粒体生物发生的关键蛋白,即毛蕊异黄酮通过促进NRF1表达,促进心肌细胞线粒体生物发生。在H9C2心肌细胞毒性模型上,采用免疫共沉淀技术和免疫荧光技术观察毛蕊异黄酮对NRF1蛋白与PGC-1α蛋白结合的影响。NRF1的表达受PGC-1α调控,本研究比较PGC-1α抑制剂SR18292加入前后,毛蕊异黄酮促进NRF1蛋白表达的作用,反向验证毛蕊异黄酮通过增加PGC-1α去乙酰化,促进NRF1表达。结果:第一部分:雷公藤甲素剂量依赖性的降低H9C2心肌细胞活力,当雷公藤甲素浓度为200 n M时,H9C2细胞活力降低为75%,因此选择雷公藤甲素200 n M作为建立H9C2心肌细胞毒性模型的浓度。黄芪甲苷(1.25～100μM)和芒柄花黄素(1.25～100μM)作用于H9C2心肌细胞后,当浓度升高至80μM时,H9C2心肌细胞活力显著降低,因此选择黄芪甲苷和芒柄花黄素的安全浓度为1.25～40μM。在黄芪甲苷和芒柄花黄素的安全浓度下,观察其抑制雷公藤甲素(200 n M)H9C2心肌细胞毒性的作用。结果黄芪甲苷和芒柄花黄素均未表现出降低雷公藤甲素H9C2心肌细胞毒性的作用。黄芪多糖(1.56～200μg/m L)和毛蕊异黄酮(1.56～200μM)对H9C2细胞活力未有显著影响,属于安全浓度范围。在雷公藤甲素(200 n M)诱导的H9C2心肌细胞毒性模型上,黄芪多糖(1.56～200μg/m L)未显示出增加H9C2细胞活力的作用。但是,毛蕊异黄酮50μM、100μM和200μM显著抑制雷公藤甲素(200 n M)诱导的H9C2心肌细胞活力降低。以上研究结果表明,毛蕊异黄酮是黄芪降低雷公藤甲素心肌细胞毒性的主要活性成分之一。第二部分:毛蕊异黄酮显著抑制雷公藤甲素诱导的H9C2心肌细胞LDH释放增加和凋亡增加。在雷公藤甲素诱导的小鼠心脏毒性模型上,毛蕊异黄酮显著降低小鼠血清中心脏损伤相关指标AST、LDH、CK-MB和c TnⅠ的含量,并显著改善雷公藤甲素引起的心脏病理损伤。毛蕊异黄酮促进微丝聚合,对抗雷公藤甲素诱导的H9C2心肌细胞骨架损伤,并显著改善雷公藤甲素诱导的小鼠心脏收缩功能下降。由此说明,毛蕊异黄酮体内、体外均显著降低雷公藤甲素诱导DS-3201生产商的心脏毒性。第三部分:雷公藤甲素剂量依赖性的降低H9C2心肌细胞线粒体呼吸链复合体亚单medical student位ATP5A、UQCRC2、SDHB和NDUFB8的m RNA和蛋白表达,减少H9C2心肌细胞mt DNA拷贝数和线粒体转录因子TFAM m RNA和蛋白表达,降低线粒体膜电位和ATP生成。由此说明,雷公藤甲素诱导心肌细胞线粒体生物发生障碍。第四部分:在雷公藤甲素诱导的H9C2心肌细胞毒性模型上,毛蕊异黄酮促进心肌细胞线粒体呼吸链复合体亚单位表达,增加mt DNA拷贝数和TFAM表达,升高线粒体膜电位,增加ATP生成、心肌细胞线粒体数量和线粒体耗氧率。在雷公藤甲素诱导的小鼠心脏毒性模型上,毛蕊异黄酮促进小鼠心脏组织线粒体呼吸链复合体亚单位表达、TFAM表达和ATP生成,并改善小鼠心脏组织线粒体超微结构。以上研究结果表明,毛蕊异黄酮体内、体外均显著抑制雷公藤甲素诱导的心肌细胞线粒体生物发生障碍。第五部分:雷公藤甲素剂量依赖性的降低H9C2心肌细胞和细胞核中PGC-1α蛋白的含量,而毛蕊异黄酮使H9C2细胞和细胞核中PGC-1α蛋白的表达增加。毛蕊异黄酮增加心肌细胞核中PGC-1α蛋白的分布,与其升高去乙酰化酶SIRT1的表达和升高NAD~+/NADH有关。PGC-1α抑制剂SR18292,诱导PGC-1α乙酰化,使毛蕊异黄酮促进线粒体呼吸链复合体亚单位表达、增加mt DNA拷贝数和ATP生成的作用被显著抑制。由此说明,毛蕊异黄酮通过促进SIRT1表达,诱导PGC-1α去乙酰化,从而促进心肌细胞线粒体生物发生。雷公藤甲素剂量依赖性的降低H9C2心肌细胞中NRF1的m RNA和蛋白表达,降低细胞核中NRF1蛋白表达。相反,毛蕊异黄酮剂量依赖性的增加H9C2细胞中NRF1的m RNA和蛋白表达,并增加细胞核中NRF1蛋白表达。H9C2心肌细胞经NRF1基因沉默后,毛蕊异黄酮促进线粒体呼吸链复合体亚单位表达和增加细胞内ATP生成的作用被显著抑制。由此说明,NRF1是毛蕊异黄酮促进心肌细胞线粒体生物发生的关键蛋白。毛蕊异黄酮通过促进NRF1表达,促进心肌细胞线粒体生物发生。在雷公藤甲素诱导的H9C2心肌细胞毒性模型中,毛蕊异黄酮对转录因子NRF1与转录激活因子PGC-1α的结合未有显著影响。但是,PGC-1α抑制剂SR18292使毛蕊异黄酮促进NRF1表达的作用被抑制。以上实验结果表明,毛蕊异黄酮上调SIRT1蛋白,诱导PGC-1α去乙酰化,增加NRF1蛋白表达,进而促进心肌细胞线粒体生物发生。结论:1.毛蕊异黄酮可能是黄芪抑制雷公藤甲素心肌细胞毒性的主要活性成分之一。2.毛蕊异黄酮体内、体外抑制雷公藤甲素诱导的心脏毒性,并保护心肌细胞骨架,改善心脏收缩功能。3.毛蕊异黄酮抑制雷公藤甲素诱导的心肌细胞线粒体生物发生障碍。4.毛蕊异黄酮上调SIRT1蛋白,诱导PGC-1α去乙酰化,增加NRF1蛋白表达,并促进心肌细胞线粒体生物发生。