背景:肺癌的发病率与死亡率一直位居全球第一,主要分为https://www.selleck.cn/products/BafilomycinA1.html小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。目前,临床上以化疗结合手术治疗为主,但随着化疗药物毒副作用的出现和肿瘤耐药的发生,多重因素限制了临床化学药物治疗效果。因此,探索一种新型、有效且副作用较小的抗NSCLC药物是十分有必要的。近年来,从植物和海洋产品等天然药物中提取的衍生抗癌化合物得到了广泛关注。藻类属于咸味中药,具有软坚散结的功效,有用于癌症治疗的记载。螺状藻和板状藻属于天然藻类,其在药理学研究中表现出较好的抗肿瘤、抗炎以及抗氧化等功效。1-Monopalmitin(1-Mono)是从螺状藻和板状藻中提取的一种单体化合物,但它在NSCLC中的作用尚未报道,因此,本文旨在探索1-Mono对肺癌细胞的影响及分子机制,为1-Mono迈入临床研究和治疗做前期实验探索。方法:购买药物1-Mono,在体外培养NSCLC细胞A549和SPC-A1,采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测细胞增殖活性,根据所测的结果计算细胞的半数抑制浓度(IC_(50)),为后续的实验确定合适的药物浓度。首先,通过形态学观察实验、CCK8实验、Ed U标记实验、结晶紫实验和划痕实验等研究1-Mono对肺癌细胞增殖、周期、凋亡等细胞生物学行为的影响。随后,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(FACS)等实验方法,研究并阐明1-Mono诱导抗肿瘤作用的相关机制。本研究以A549和SPC-A1为研究对象,探索了1-Mono对NSCLC生物学功能的影响,阐述1-Mono在肺癌治疗中的作用;分子机制方面主要探索了自噬和PI3K/Akt信号通路在1-Mono抗癌中的作用。结果:本实验主要分为6个方面:1.1-Mono以剂量依赖的方式抑制肺癌细胞增殖首先用不同浓度的1-Mono处理A549和SPC-A1细胞48 h后,用CCK8法检测细胞活力,得出1-Mono可有效降低A549和SPC-A1细胞的增殖,且呈剂量依赖性;其次计算出A549和SPC-A1细胞的半抑制浓度值分别为50.12μg/m L和58.30μg/m L,且1-Mono对正常细胞系HBE(半抑制浓度=161.34μg/m L)不敏感,表明1-Mono具有较低的细胞毒性。接下来采用Ed U染色法证明1-Mono可以通过抑制细胞DNA合成来降低细胞的增殖活性,结晶紫染色进一步证实1-Mono可降低NSCLC的增殖。总之,我们发现1-Mono可以抑制NSCLC细胞的增殖。2.1-Mono诱导NSCLC细胞周期阻滞在G2/M期采用碘化丙啶(PI)染色法研究1-Mono对肺癌细胞周期分布的影响,得出1-Mono抑制A549和SPC-A1细胞的分裂并将其阻滞于G2/M阶段。随后,Western blot观察到1-Mono处理后Cyclin D1的表达下调,而p21的表达上调,证实了1-Mono通过调控p21和Cyclin D1诱导G2/M阻滞。总之,1-Mono通过调节Cyclin D1和p21诱导肺癌细胞G2/M阻滞。3.1-Mono抑制NSCLC细胞迁移1-Mono对肺癌细胞迁移的影响主要通过划痕实验实现。用不同浓度的1-Mono(0μg/m L、50μg/m L)分别处理A549和SPC-A1细胞0 h、24 h、48 h后对结果拍照,显示1-Mono处理组(50μg/m L)0 h、24 h、48 h时的划痕修复能力均显著低于A549和SPC-A1的1-Mono对照组(0μg/m L)。提示1-Mono能通过抑制肺癌细胞的迁移能力发挥抑癌作用。4.1-Mono主要通过诱导细胞凋亡杀死肺癌细胞通过流式细胞术检测细胞凋亡率来证实1-Mono以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡发生的比例。1-Mono还显著增加了Caspase-3活化及其下游底物PARP切割(两个常用于检测细胞凋亡的标记)。此外,结果显示,经过1-Mono处理后,IAPs(c-IAP1、c-IAP2、RIP1、RIP3、XIAP、Survivin)(细胞死亡的主要调控因子)蛋白的表达明显受到抑制。采用流式细胞术检测1-Mono能显著促进在细胞凋亡中起关键作用的活性氧(ROS)水平的累积。Western blot分析提示1-Mono以时间梯度诱导对凋亡过程中DNA碎裂不可或缺的H2A.X的磷酸化水平。以上结果提示1-Mono通过诱导细胞凋亡介导细胞毒性。5.1-Mono诱导NSCLC的保护性自噬Western blot分析显示1-Mono诱导LC3-II累积和p62降解,这进一步通过自噬潮实验得到了验证。用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)抑制自噬活性可显著增强1-Mono诱导的细胞毒性,表明自噬可能是一种细胞保护机制。6.PI3K/Akt通路介导1-Mono诱导的抗肿瘤作用Western blot结果表明1-Mono过度激活了PI3K和Akt的磷酸化。使用抑制剂LY294002和Wortmannin分别抑制PI3K/Akt的活性均能有效逆转1-Mono诱导的细胞毒性。综上所述,这些结果提示PI3K/Akt在1-Mono诱导的细胞毒性中起重要作用。结论:综上所述,我们的研究结果表明,1-Mono抑processing of Chinese herb medicine制肺癌细胞增殖、将细胞周期阻滞在G2/M期、抑制细胞迁移以及主要通过诱导细胞凋亡来杀死癌细胞。此外,1-Mono诱导了细胞保护性自噬,因为自噬抑制剂氯喹显著增强了1-Mono诱导的细胞毒性。我们的数据还表明,我们还研究了PI3K/Akt信号通路在1-Mono细胞毒性中的作用,进一步证实1-Mono过度激活PI3K/Akt通路,因为通过LY294BI 10773浓度002和Wortmannin抑制PI3K/Akt通路活性,部分减弱了1-Mono介导的抗癌活性,表明1-Mono诱导的抗肿瘤作用依赖于PI3K/Akt通路。总之,我们的研究结果显示,1-Mono杀死肺癌细胞主要通过PI3K/Akt通路发挥效应,为研发肺癌的治疗提供了新的参考,但目前仍有必要进行进一步的体外和体内实验来验证和丰富这些结果,并分析其它深入的分子机制。