桦褐孔菌(Inonotus obliquus)是一种广泛分布于主要分布于北欧、北美和中国的东北兴安岭以及山西的森林地带。桦褐孔菌为药用真菌,其重要的次生代谢产物酚类和三萜显示出抗氧化、抗肿瘤、改善代谢相关疾病等生物活性。线粒体氧化状态的不平衡,将导致高活性自由基如单线氧和超氧化物分子的产生。近年的研究报道表明,桦褐孔菌酚类和三萜提取物有优异的抗氧化及干预氧化应激相关疾病的活性,但针对桦褐孔菌酚类和三萜类物质清除自由基、激活抗氧化酶机制缺乏深入研究。多糖是桦褐孔菌中含量最高的组分,研究报道桦褐孔菌多糖可以有效干预肿瘤的发展。模拟胃酸消化后的多糖、碱溶性多糖和化学修饰多糖显示出更强的生物学活性,但缺乏多糖的结构与抗肿瘤活性的相关性研究。近年来的研究报道多种桦褐孔菌多酚及多糖的提取技术在大规模提取的应用过程中存在设备昂贵、操作技术要求高等问题。本论文利用数学模型拟合不同条件下固液萃取桦褐孔菌酚类、多糖的动力学过程,分析影响提取率的因素和传质步骤,进而筛选出酚类和多糖固液萃取的最优条件,应用泛函密度理论和抗氧化实验分析桦褐孔菌酚类、三萜化合物清除自由基的机制,借助酶活力检测技术、分子对接和分子动力学模拟分析酚类化合物激活SOD和CAT的分子机制,在细胞水平构建NAFLD模型探索三萜通过降低细胞氧化应激水平干预相关疾病的可能,利用化学方法、光谱分析技术和电子显微成像技术分析多糖的结构与生物学活性之间的关系。主要研究结果如下:1.采用顺序柱层析提取了桦褐孔菌的主要次级代谢物:三萜、自由态酚类、结合态酚类。通过HPLC-DAD-MS分析了提取物的化学组成。三萜提取物主要成分被鉴定为inoterpenes F、botulin、inonotsulides C、trametinolic acid、inotodiol、inotsudiol A、inoterpenes E和ergosterol。自由态酚类的组成被鉴定为protocatechuic aldehyde、catechin、aquilarin A、phelligridin D、phelligridin E和phelligridin G,结合态酚类的主要成分为2,5-dihydroxyterephthalic acid、8-demethyleucalyptin和phelligridin E。自由态酚类具有较强的自由基清除活性和Fe~(2+)还原力SCH772984。三萜提取物显示出较强的抗肝脂质过氧化活性和抗结肠癌细胞增殖活性。三萜提取物抑制了结肠细胞的增殖,阻断了细胞周期从G1期到S期的转变,促进细胞凋亡。2.动力学拟合结果显示酚类化合物从材料中心向溶剂外层的扩散(外扩散)是决定酚类提取效率的关键步骤。溶剂、pH和温度既影响溶剂向材料中心的扩散(内扩散)又影响外扩散。酚类化合物在乙醇中具有较高的外扩散速率,在水中具有较高的内扩散效率(溶剂具备低粘度,高极性)。将乙醇和水组合以后同时提高了内扩散和外扩散速率。在333 K,50%的乙醇(pH13)作为提取溶剂、材料粒度为120μm、液固比为25 m L/g的条件下对桦褐孔菌子实体进行萃取可以获得较高的总酚产率。pH影响提取物中酚类化合物的组成,在333 K,50%的乙醇(pH5)作为提取溶剂、粒度为120μm、液固比为25 m L/g的条件下总酚得率略低于pH13下的提取,但提取物中酚类化合物种类更多。3.应用LH20 Sephadex柱色谱法结合制备HPLC,从桦褐孔菌自由态多酚提取物中分离并纯化了12种酚类化合物。苯乙烯基吡喃酮多酚(methylinoscavin B、interfungin、phelligridin I和phelligridin E)特别是methylinoscavin B和interfungin B比其他酚类化合物具有更强的抗氧化活性。基于密度泛函理论(DFT)的计算结果显示methylinoscavin B比其他酚类化合物具有更低的能隙,更高的柔软度和更高的电子化学势。当与·OOH(被选为代表性自由基)反应时,methylinoscavin B分子C7’位O-H键的键解离能值小于C11和C6’位。酚类化合物与自由基反应时,氢原子转移(HAT)比单电子转移(SET)更容易发生。用终浓度为0.5、1、2、3、4和5μM的phelligridin E处理后,SOD1的活性分别增加了70.15%、11.36%、145.45%、172.73%、205.05%和275.23%。分子动力学模拟(MD)结果显示,SOD1的ASP147和phelligridin E之间的氢键促进GLU223-ARG224与phelligridin E的结合进而形成稳定的C-coil。C-coil增强了SOD1的静电环(EL)的稳定性并可能加快超氧阴离子向活性中心的移动。钼酸铵显色分析的结果显示,phelligridin E和phelligridin I显示出增强CAT活性的能力,特别是phelligridin E。经终浓度分别为0.5,1,2,3,4和5μM的phelligridin E处理后,CAT的活性分别增加了41.90%,44.68%,52.66%,58.10%,62.78%和68.10%。分子对接和分子动力学模拟结果表明phelligridin E与CAT的ASN369、HIS372、ILE373形成较强的疏水作用力,与CAT的ASP25、ASN369、HIS372、PRO391和CYS393形成氢键。应用gmx＿MMPBSA进行自由能分解发现CAT的GLU67、ILE373和PRO391对phelligridin E与CAT的结合贡献较大。Phelligridin E与CAT之间相互作用促使CAT的VAL41、CYS393、ASP396、GLY399、GLY400发生二面角扭转进而推动ASN33-GLN53形成B-Sheet、CYS393-ASN403形成5-Helix、ASN433-ASP438形成3-Helix。CAT二级结构的转变拉伸了活性中心上下区域之间的距离,增加了底物进入活性中心的途径,增强了CAT消除过氧化氢的能力。4.采用中压色谱法结合制备液相色谱法从桦褐孔菌中分离出7种三萜类化合物。通过LC-MS和NMR分析了化合物的结构。七种三萜类化合物被鉴定为betulin、inonotsulide C、trametenolic acid、inotodiol、inonotsudiol A、inoterpene E和ergosterol。基于DFT方法的计算结果显示三萜化合物的HOMO轨道主要分布在O-H附近,而LUMO轨道分布于环内C=C键附近。ergosterol具备较小的能隙_ΔE、较高的柔软度(S)、较低的电负性(χ)和较强的电子转移能力。Ergosterol倾向通过SET机制清除自由基。其余三萜化合物特别是betulin更容易通过HAT途径清除自由基、抵抗肝脂质过氧化。Betulin具备最低的BDE值,更容易向自由基转移H原子。体外抗肝脂质过氧化实验结果证实betulin和ergosterol都具有良好的抑制肝脂质过氧化能力。细胞水平分析结果显示betulin和ergosterol均可有效缓解非酒精性脂肪肝(NAFLD)细胞中脂质的累积。所有桦褐孔菌三萜化合物对肝L02细胞无明显毒性,且可以有效改善NAFLD导致的细胞活力下降。Betulin在缓解FFA诱导引起的脂质累积、降低肝细胞损伤、增强细胞SOD和CAT的活力等方面显示出较强的活性。Betulin还以剂量依赖的方式减少线粒体膜损伤、改善线粒体功能障碍、增强FG-4592体内实验剂量溶酶体活性。5.桦褐孔菌多糖的提取动力学模型显示传质模型在拟合实验数据时具有较高的R~2和较低的X~2,拟合效果好于一阶动力学模型。热力学分析发现,pH13的条件下多糖的溶剂化焓为负值(ΔG>0),表明这个过程可以自发进行。在pH13、粒径120μm,液固比60 m L/g的条件下无需加热就获得较高的多糖的产量。化学分析显biosilicate cement示桦褐孔菌多糖为具备三股螺旋结果的酸性多糖-蛋白复合物,单糖的主要构型为吡喃型,最多的单糖为甘露糖。光谱学分析结果显示pH13条件下提取的多糖具有更低的分子量和黏度,同时甘露糖含量下降。电子显微镜成像结果显示pH13条件下提取的多糖具有更光滑的表面形貌和更细的三股螺旋结构。这可能解释了pH13条件下提取的多糖具有更强的抑制结肠癌活性。综上所述,本文借助数学模型优化了常规大规模提取桦褐孔菌酚类、多糖的条件,分析了决定产物得率的关键步骤、pH对提取物组分的影响,利用色谱技术分离得到12种酚类化合物和7种三萜,结合泛函密度理论方法和体外抗氧化实验筛选出活性较强的自由基清除剂(methylinoscavin B)、抗肝脂质过氧化物(betulin和ergosterol),并分析了它们抗氧化的机制。应用酶活分析技术和分子模拟技术筛选并分析了phelligridin E激活SOD1和CAT的机制,结合化学分析方法、光谱学技术和电子显微成像技术尝试解释碱溶性和酸消化多糖具有更优异抗结肠癌活性的机制。