黏膜是机体免疫的第一道防线,通过口服、滴鼻、点眼等黏膜途径免疫,可有效诱导保护性黏膜免疫反应。但目前绝大多数的黏膜疫苗仍未开发,且缺乏安全有效的免疫佐剂。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)作为枸杞子的主要活性成分,具有抗氧化、抗病毒、细胞保护和免疫调节等多种药理活性。相较于传统的介孔二氧化硅纳米颗粒,超大介孔二氧化硅纳米颗粒(Ultra-large mesoporous silica nanoparticles,UCMS)在作为药物或亚单位疫苗的递送载体方面更具优势。本研究结合了 LBP和UCMS两者优势,开发了一种新型中药多糖纳米黏膜免疫佐剂,既可以保护抗原,又可以更好地发挥中药多糖的免疫功效。1.LBP-UCMS的制备及表征评价本试验采用溶胶-凝胶法制备UCMS纳米材料,然后利用吸附法将LBP负载于UCMS纳米粒中,制备得到枸杞多糖超大介孔二氧化硅(Ultra-large pore mesoporous silica nanoparticles loading lycium barbarum polysaccharides,LBP-UCMS)。通过一系列检测方法对LBP-UCMS进行全面表征评价,并连续灌服小鼠1selleckchem4 d LBP-UCMS来评估其经口毒性。结果表明,LBP-UCMS呈球形,尺寸大小均一,平均粒径为493.4±14.17 nm,带负电;具有大介孔结构,且LBP成功负载于UCMS中,多糖负载率达21.92%。LBP-UCMS在胃模拟液中释放率较低,在肠道模拟液中释放率高达88.4%,表明UCMS可防止LBP在胃液中降解,使其进入肠道发挥作用。亚急性经口毒性试验结果表明LBP-UCMS对小鼠没有明显毒性,具有良好的安全性。2.LBP-UCMS对免疫细胞的影响本试验探究了 LBP-UCMS对小鼠巨噬细胞RAW264.7Roxadustat体内实验剂量和骨髓源树突状细胞(Dendritic cells,DCs)免疫功能的影响。利用流式细胞仪检测LBP-UCMS对巨噬细胞和DCs表面共刺激分子的表达水平;在激光共聚焦显微镜下,观察在LBP-UCMS的刺激下,巨噬细胞吞噬FITC-dextran能力的影响;采用RT-qPCR法检测LBP-UCMS对巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平的影响。结果表明,LBP-UCMS可显著提高巨噬细胞和DCs表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD86和CD80的表达量。LBP-UCMS促进巨噬细胞的吞噬功能,增强巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6等细胞因子的能力,表现出比LBP更佳的免疫效果。3.LBP-UCMS对小鼠口服H9N2灭活疫苗的黏膜免疫效果的影响本试验研究了 LBP-UCMS作为H9N2亚型禽流感灭活疫苗黏膜佐剂口服免疫的效果及机理。将150只5周龄BALB/c小鼠随机分为6组,每组25只,包括Control、WIV、WIV+LBP、WIV+UCMS、WIV+LBP-UCMS、WIV+CT 组。第 0d 首次 口服免疫佐剂与抗原,14 d后加强免疫,经典的黏膜佐剂霍乱毒素(Cholera toxin,CT)作为阳性对照。通过血清抗体效价和小鼠脾脏T细胞(CD3+、CD4+/CD8+)表型变化来评价LBP-UCMS作为黏膜免疫佐剂诱导全身免疫应答的水平。通过测定十二指肠和空肠的绒毛长度、隐窝深度及绒隐比,检测空肠洗液中sIgA的含量和空肠组织中IgA α-chain、J-chain和pIgR的mRNA表达量,以及TLR4、MyD88和pIgR的蛋白表达水平来评价LBP-UCMS作为黏膜免疫佐剂诱导黏膜免疫应答的水平。结果表明LBPMicro biological survey-UCMS作为黏膜免疫佐剂口服免疫小鼠后,血清抗体效价提升,淋巴细胞中CD3+亚群的比率和CD4+/CD8+T细胞比例增大。LBP-UCMS还能促进小鼠十二指肠和空肠对营养物质的吸收,促使分泌sIgA抗体以及提高TLR4、MyD88和pIgR的蛋白表达水平。综上所述,LBP-UCMS提高了机体的全身免疫应答和黏膜免疫应答水平,表现出作为安全有效黏膜免疫佐剂的潜力。