近年来痛风和高尿酸血症已经成为不可忽视的疾病,随着现代生活方式的改变,痛风患者人数大量增加,且呈现发病年龄逐渐年轻化的趋势,急需研发具有自主知识产权的药物和健康产品。药用真菌能够产生活性次级代谢产物,可以有效地防治痛风相关疾病。痛风的发生与机体内尿酸含量过高有直接关系,而杨树桑黄(以下简称杨黄)具有抑制尿酸等活性,相对于合成药物的毒副作用,天然食药真菌更符合现代健康理念。因此,深入加强药用真菌的药效基础研究,并从分子水平对杨黄的抗痛风作用机理进行多方面的探讨具有一定的现实意义。首先,以同neuro-immune interaction一杨黄菌种为研究对象,采用苯酚-硫酸法、福林酚法分别对不同生长年份和野生杨黄提取物中的总多糖(水提物)和总多酚(醇提物)含量进行评价,并应用液相色谱-质谱联用(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)分析比较了不同生长年份杨黄醇提物中主要活性成分。结果表明:一年生杨黄中总多糖含量较高,而四年生杨黄中总多酚含量较高;通过色谱谱图比较发现,杨黄菌丝体中活性成分种类较少、含量低,与总多酚含量测定结果相符,人工栽培杨黄和野生杨黄的提取物中主要成分比较相近,野生杨黄中成分种类较多,但人工杨黄中个别成分含量高于野生;应用LC-MS技术初步鉴定了杨黄提取物中6种化合物,分别为phellinin B、phelligridimer A、davallialactone、phellinstatin、hypholomine B和inoscavin A。其次,以对黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)抑制率为指标,评价杨黄不用方法提取物的XO抑制活性,以95%乙醇为提取溶剂,采用超声、回流、冷浸法制备杨黄提取物,测定其总多酚含量及XO抑制率;以XO为作用靶点建立体外快速的药效学筛选方法,通过超滤质谱技术筛选提取物中潜在的XO抑制剂;采用高效逆流色谱技术(high-speed counter-current chromatography,HPBafilomycin A1研究购买CCC)分离活性成分,并应用色谱、质谱等技术分析并鉴定其化学结构。结果表明:100μg/m L杨黄回流法提取物对XO抑制率较高,为88.21%,而冷浸提取物对XO抑制率较低,为75.88%;采用超滤质谱技术从提取物中筛选出7种潜在的XO抑制剂,初步鉴定分别为osmuncacetone、hypholomine B、inoscavin A、phelligridin D、phelligridin C、3-[4,5-Dihydroxy-2-(6-methyl-4-oxo-4H-pyran-2-yl)Phenyl]-6-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)vinyl]-4-hydroxy-2H-pyran-2-one、phelligrins A;利用HPCCC技术从杨黄提取物中分离得到两种化合物,其纯度均达到90%以上,经质谱鉴定分别为phellinin B和davallialactone。再次,以尿酸钠(monosodium urate,MSU)诱导RAW264.7巨噬细胞建立急性痛风损伤模型,检测杨黄提取物对模型细胞中TNF-α、IL-1β、SOD、活性氧、一氧化氮含量的影响,评价提取物对急性痛风细胞的保护作用;进一步采用Western Blot技术检测基于NLRP3炎性小体和TLR4/NF-κB炎症等信号通路中相关蛋白的表达。结果表明:与模型组相比,5.00μg/m L提取物细胞上清液组的ⅠL-1β含量显著降低(p<0.05),10.00、20.00μg/m L提取物组的ⅠL-1β、TNF-α含量极显著降低(p<0.01);5.00、10.00、20.00μg/m L提取物组的活性氧含量极显著降低(p<0.01);10.00、20.00μg/m L提取物组的NO含量分别显著、极显著降低(p<0.05,p<0.01);5.00、10.00、20.00μg/m L提取物组的SOD含量显著升高(p<0.05)。Western Blot实验结果证实杨黄提取物可以下调模型细胞中TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3、ⅠL-1β蛋白的表达水平,抑制NLRP3炎性小体和TLR4/NF-κB通路信号转导,从而发挥抗痛风炎症作用。最后,选择具有较好XO抑制活性的单体化合物davallialactone,采用多光谱方法和分子对接模拟技术综selleckchem合分析单体抑制剂与XO的相互作用机制。结果表明:davallialactone与XO的碰撞导致XO的荧光猝灭和构象变化,这主要是由疏水作用驱动。此外,圆二色光谱法结果表明davallialactone能改变XO二级结构,其中α-螺旋含量降低,使得davallialactone能诱导XO结构由紧凑变疏松,降低了XO的催化能力。分子模拟结果表明,davallialactone位于XO的Mo-Pt中心,与氨基酸残基Phe798、Arg912、Met1038、Ala1078、Ala1079、Gln1194和Gly1260相互作用,同时观察到davallialactone结构中的苯环与Phe914之间面对面的π-π相互作用,表明氢键和π-π相互作用在稳定的结合构象中不容忽视。本文应用多学科的理论和方法,开展地方特色、非常规食药用菌杨黄的药效物质基础以及抗痛风活性研究,对保护我国食药用真菌资源及深入开发利用具有重要意义。