背景:新生隐球菌是一种机会性致病真菌,当个体的免疫系统受损时,感染该菌将导致肺部和全身性的隐球菌病,最终发展成致命的隐球菌性脑膜炎,它是撒哈拉以南非洲成年人中最常见也是最严重的HIV相关机会性感染之一。临床上治疗隐球菌感染的药物十分有限,仅有氟康唑、两性霉素B和氟胞嘧啶三种,但由于药物供应不足、耐药性频发以及药物的毒副作用,临床药物的治疗作用存在局限性,导致HIV相关隐球菌脑膜炎的死亡率一直居高不下。因此,亟需寻找新的抗菌药物靶点,开发新的抗菌疗法来缓解日益严峻的隐球菌感染形势。近年来,真菌必需氨基酸的生物合成途径被认为是理想的抗真菌药物的分子靶标,它不仅对真菌的生长和毒力具有重要影响,同时部分合成步骤与哺乳动物细胞中不同,有望能够有效避免药物发生毒副作用。半胱氨酸生物合成途径是硫代谢中的核心途径,能够帮助病原真菌抵抗宿主条件下的生存压力。鉴于半胱氨酸生物合成途径的重要生理功能,鉴定和表征新生隐球菌中半胱氨酸合成酶并解析其致病过程中发挥的关键的作用可为防控隐球菌脑膜炎提供新的思路,并为抗隐球菌感染的药物开发提供坚实的理论依据。目的:鉴定新生隐球菌中半胱氨酸合成酶Cys1和Cys2,并表征其功能。解析新生隐球菌中完整的半胱氨酸生物合成途径,完善真菌半胱氨酸代谢途径。分析半胱氨酸合成酶对新生隐球菌生长和致病性的关键作用并研究Cys1的作用机制,探讨Cys1成为隐球菌脑膜炎的治疗药物靶点的可能性,为开发新型抗真菌感染药物提供理论基础。方法:1.生信分析结合遗传表型实验鉴定新生隐球菌的半胱氨酸合成酶,通过分析敲除株cys1Δ和cys2selleck NMRΔ对硫代谢相关化合物的利用情况,解析新生隐球菌的半胱氨酸代谢途径。2.利用营养匮乏、氧化压力、金属离子压力以及其他外界压力,测试敲除株的应激表型,阐述半胱氨酸合成酶与新生隐球菌逆境适应性能力之间的重要联系。3.测试半胱氨酸合成酶缺失对毒力因子表达的影响,并通过构建小鼠感染模型探究CYS1缺失对新生隐球菌致病性的影响,初步解析cys1Δ菌株毒力减弱的成因。4.测试cys1Δ对抗真菌药物氟胞嘧啶、氟康唑、两性霉素B敏感性的影响,探究半胱氨酸合成酶缺失后是否与临床抗菌药物存在协同作用。5.大肠杆菌异源表达和分离纯化Cys1,测试其酶活性。结果:transplant medicine1.新生隐球菌的半胱氨酸合成酶Cys1和Cys2,都处于O-乙酰丝氨酸途径中,分别发挥O-乙酰丝氨酸巯基裂解酶和丝氨酸乙酰转移酶的功能。半胱氨酸代谢途径中各代谢产物的利用情况表明,O-乙酰丝氨酸途径与反转硫途径是具有生理活性的半胱氨酸生物合成途径,并且O-乙酰丝氨酸途径是新生隐球菌中主要的半胱氨酸生物合成途径,而反转硫途径是次要的半胱氨酸生物合成途径。2.CYS1或CYS2的缺失都导致新生隐球菌的生长严重依赖半胱氨酸,饥饿实验和氧化应激实验的结果表明这可能是由于cys1Δ、cys2Δ的抗氧化防御能力受损所导致,此外,半胱氨酸合成酶的缺失还将导致敲除株对铜离子和钴离子敏感,而cys1Δ、cys2Δ在添加了刚果红和SDS的培养基上生长缺陷的结果表明了半胱氨酸合成酶的缺失还影响新生隐球菌细胞膜的完整性。3.毒力因子的测试情况显示半胱氨酸合成酶的缺失导致新生隐球菌的毒力减弱。小鼠鼻滴感染模型显示CYS1缺失导致突变株在脑部的毒力减弱;小鼠静脉感染模型显示,CYS1缺失并不影响新生隐球菌向脑部的早期传播。脑部贫乏的营养基质可能是敲除株在体内毒力减弱的重要原因。4.氟胞嘧啶对cys1Δ、cys2Δ的生长没有影响,但氟康唑和两性霉素B严重抑制了敲除株的生长,而外源添加半胱氨酸完全无法挽救氟康唑的生长抑制作用。5.通过在大肠杆菌中对新生隐球菌半胱氨酸合成酶Cys1进行异源表达,并在体外成功纯化了Cys1和去定位的Cys1蛋白,两者都显示出了O-乙酰丝氨酸巯基裂解酶活性。结论:Cys1和Cys2是新生隐球菌的半胱氨酸合成酶,其中Cys1发挥O-乙酰丝氨酸巯基裂解酶功能,Cys2发挥丝氨酸乙酰转移酶功能,二者组成了O-乙酰丝氨酸途径,并在半胱氨酸的生物合成中起主要作用。CYS1或CYS2的缺失都将导致新生隐球菌的抗氧化防御能力减弱,金属离子耐受性降低,并损害细胞膜完整性,从而影响隐球菌的生长。CYS1缺失影响了新生隐球菌的毒力因子的表达,并减弱了新生隐球菌在脑部的致病性,经过初步探索,本研究发现这与新生隐球IACS-010759使用方法菌向脑部的早期传播能力无关,而与脑部贫乏的营养基质有关。