【目的】探索降低富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)中的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的方法,对比不同活化方法制备的PRP治疗玫瑰痤疮小鼠的效果并研究其病理机制。【方法】1、收集健康成年男性全血于含柠檬酸葡萄糖抗凝剂A(Acid-citrate dextrose A,ACD-A)试管中,通过两步离心法制备PRP。使用全自动血液分析仪检测制备的PRP中的血小板数量,通过与全血中血小板数量对比,以确定制备的PRP质量。2、采用冻融活化法制备PRP。离心去掉破碎的血小板及少量的血细胞,取上清液用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测生长因子浓度。将剩下的富血小板血浆释放物通过免疫磁珠法去除VEGF-A,将产物通过ELISA试剂盒检测VEGF-A浓度,与免疫磁珠法处理前做对比。3、贝伐珠单抗去除冻融活化PRP中的VEGF-A,并用ELISA试剂盒检测贝伐珠单抗处理前后PRP中的VEGF-A浓度变化。4、通过ELISA试剂盒检测对比冻融活化的PRP和血浆中的VEGF-A浓度。5、将PRP储存在4℃、24℃及-80℃下。分别于0、3、7天检测VEGF、HGF、PDGF、EGF、FGF等生长因子浓度变化。6、对10%氯化钙(Calcium chloride,Ca Cl_2)活化的PRP、冻融活化的PRP、新鲜的PRP及血浆使用ELISA试剂盒检测血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、VEGF、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)等生长因子水平。7、取20只7周龄BALB/c雌鼠,通过皮内注射LL-37抗菌肽诱导小鼠皮肤产生红斑以制备玫瑰痤疮小鼠模型。采用HE染色及免疫组化检测CD31、F4/80、LY6G、IL17等指标,以评估造模结果。将造模成功的20只玫瑰痤疮模型小鼠通过随机分组分为四组,A组采用钙离子活化的PRP皮内注射治疗,B组采用冻融活化的PRP皮内注获悉更多射治疗,C组采用新鲜的PRP皮内注射治疗,D组采用生理盐水皮内注射作为阴性对照。通过连续的拍照记录,后期采用Imagej计算红斑面积变化并采用HE染色、Masson染色及免疫组化检测CD31、F4/80、LY6G、selleck化学IL17等指标以对比各组的治疗效果。Hepatocyte growth【结果】1、成功制备PRP,通过全自动血液分析仪检测制备的PRP中血小板数量是全血基线的3倍。2、免疫磁珠法去除制备PRP中的VEGF-A后,通过ELISA试剂盒检测发现免疫磁珠法处理前后的PRP中VEGF-A浓度差异不具有显著性(P>0.05)。3、贝伐珠单抗处理PRP前后通过ELISA试剂盒检测的VEGF-A浓度差异不具有显著性(P>0.05)。4、冻融活化的PRP产生的VEGF-A浓度比血浆中的浓度显著降低(P<0.05)5、PRP在不同温度下储存时,其中的各种生长因子随着时间推移浓度出现不一致地变化。6、通过Ca CL2活化的PRP各项检测的生长因子如EGF、FGF、PDGF、VEGF浓度高于其他组。其中HGF在各组中未表现出明显差异。冻融活化的PRP中VEGF浓度低于其他组。7、成功制备玫瑰痤疮小鼠模型,HE染色及免疫组化结果显示红斑处存在大量炎性细胞浸润以及大量异常增生的毛细血管。动物实验:A组小鼠在注射Ca Cl2活化的PRP后红斑面积明显增大并且出现皮肤坏死的症状。B组两次冻融活化的PRP皮内注射治疗后两天内红斑面积较D组(对照组)有所改善。C组治疗后出现了红斑面积反常增大。8、HE染色、免疫组化及Masson染色结果提示:HE染色中冻融活化的PRP组组织结构最接近正常皮肤,新鲜PRP组出现CD31阳性密度增高。CD31在钙离子活化的PRP组与生理盐水组无明显差异,冻融活化的PRP组在注射点中心区域附近表现出较低的阳性密度。F4/80在各组中无明显差异。各组中均能观察到IL37的阳性染色,其中钙离子活化PRP组相对阳性染色面积更高。Ly6G染色结果为无特异性阳性。Masson染色提示钙离子活化的PRP组产生了大量的红染组织,胶原纤维结构破坏,面积减少。冻融活化的PRP组与对照组相比真皮层胶原蛋白增生,皮肤附属器形态正常。新鲜PRP组同样出现大量红染组织,正常皮肤结构破坏,皮肤附属器破坏。【结论】1、钙离子活化的PRP易产生大量生长因子,且高浓度的钙离子可能引起局部皮肤产生严重的炎症反应,不建议在临床治疗中使用钙离子活化PRP。2、冻融活化的PRP可以降低VEGF的释放,有利于减少PRP治疗玫瑰痤疮的异常血管增生。3、PRP中的生长因子浓度随着储存温度、储存时间和活化方法的不同而变化。根据PRP的临床用途,选择适当的储存条件和活化方法可优化其效果。4、新鲜PRP中的VEGF在玫瑰痤疮治疗中有一定促进异常血管增生的作用,加重红斑症状等不良反应。