干旱对农gibberellin biosynthesis业生产和人类活动造成了严重威胁,在过去十年中,由于干旱造成的全球作物生产损失已经增加到约300亿美元。随着全球人口的增加,对水的需求也将增加。我国降雨在地理分布上呈现南多北少,东多西少的常态,北方地区长期面临着土壤干旱的巨大挑战,干旱面积占全国耕地总面积的一半以上。因此,阐明植物抗旱的分子机制和发掘植物的抗旱调控网络是现代农业发展的一个重大挑战,对农业可持续发展至关重要。植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)作为重要的逆境激素,是植物应对逆境的重要调节激素之一。植物体内的ABA由ABA受体Pyrabactin resistance 1(PYR1)和PYRPUN30119临床试验1-like(PYL)proteins(PYLs)所感知,并由其启动下游信号调控网络。ABA受体的转录后调控是激活ABA信号的重要因素,已经成为众多研究的主题。钙离子(Ca~(2+))是真核生物中常见的第二信使之一,一直是植物细胞信号转导的难点和热点。外界刺激所产生的Ca~(2+)信号由Ca~(2+)感受器所感知,钙调素磷酸酶B亚基蛋白Calcineurin B-like proteins(CBLs)及其互作蛋白激酶CBL-Interacting protein kinases(CIPKs)作为一类重要的Ca~(2+)感受器,广泛参与调控植物生长发育与逆境胁迫等过程。在干旱胁迫下,ABA通过环核苷酸门控通道Cyclic nucleotide gated channels(CNGCs)介导的胞质Ca~(2+)的震荡在植物响应干旱中同样发挥着重要作用。然而,目前还没有研究明确Ca~(2+)信号是否可以反馈调节ABA信号传导。本文通过一系列的生理学和细胞生物学实验发现,Ca~(2+)感受器CBL1/9-CIPK1通过磷酸化修饰ABA受体PYLs负向调控ABA信号与干旱胁迫响应。此外,研究结果解决了一个长期存在的争议,即虽然CBL1/9-CIPK23复合物激活了S型阴离子通道(Slow anion channel-associated 1)SLAC1,但cbl1/9和cipk23突变体表现出耐旱表型。本研究表明,cbl1/9的耐旱表型是负调控ABA受体的造成的。CBL1/9-CIPK可能优先调节ABA受体的活性来负向调节干旱胁迫。以上研究表明,CBL1/9-CIPK1对PYLs活性的负调控是植物优化生长和响应干旱胁迫的一个关键机制。论文的主要结果如下:1.由于cipk1突变体在Ws背景中已经报道对外源ABA敏感,基于不同生态型之间植物表型可能具有差异,首先采用反向遗传学手段发现在Col背景下,CIPK1基因的突变同样会导致拟南芥对ABA敏感。通过表达CIPK1启Dinaciclib小鼠动子驱动的GUS发现CIPK1在气孔中具有高表达,进一步通过土壤干旱以及气孔开度测量等实验证实了CIPK1可能是拟南芥响应ABA信号和干旱胁迫的一个负调控因子。同时对与CIPK1互作的CBL1/9加以研究,发现CBL1/9-CIPK1复合体参与负向调控ABA信号及干旱胁迫响应。2.通过酵母双杂交实验发现CIPK1与ABA受体存在互作可能,随后的双分子荧光互补(Bi FC)实验发现CIPK1与PYLs之间的互作在细胞核、细胞质以及细胞膜上均存在。使用分裂荧光素酶互补(LCI)实验,体外Pull-down实验以及Co-IP实验进一步证实了CIPK1与ABA受体PYR1/PYL1/PYL2/PYL3/PYL4/PYL5/PYL6之间的物理相互作用。此外,利用烟草叶肉细胞原生质体观察到在表达CBL1时,CIPK1与PYLs的互作仅发生在质膜上。3.利用体外磷酸化实验发现CIPK1能够在PYL4保守的Ser129位点磷酸化修饰PYLs以调控PYLs的活性。利用体外重组ABA信号通路以及体外磷酸酶活性等实验发现CIPK1磷酸化修饰的PYLs是无活性的,在存在ABA的条件下不能抑制ABI1的磷酸酶活性。酵母双杂交以及体外Pull-down实验表明磷酸化影响了PYLs与ABI1的互作。同时对磷酸化的PYL4进行了体内分析,结果表明磷酸化不改变PYL4的定位,仅导致PYL4的失活,PYL4和PYL4~(S129A)植物恢复了ABA受体五突变体pyr1pyl2458(12458)对ABA的耐受性和干旱敏感性,同时恢复了生长缺陷表型,而模拟磷酸化的PYL4~(S129D)植物则表现出与12458植物相似的表型。综合体内体外实验结果,说明CIPK1磷酸化的PYLs是无活性的PYLs。4.利用LCI实验发现Sn RK2.6不与CIPK1互作,不参与CIPK1对ABA受体的调节过程。其次通过外源添加ABA发现,使用Co-IP实验以及磷酸化实验证实ABA直接影响CIPK1与PYLs之间的物理互作,进而影响CIPK1对PYLs的磷酸化。最后通过构建12458/cipk1突变体进行遗传学实验表明CIPK1位于PYLs上游磷酸化PYLs发挥功能。基于上述研究内容提出了Ca~(2+)信号负向调节ABA信号的新机制。在正常条件下,Ca~(2+)感受器CBL1/9-CIPK1通过在保守的PYL4~(S129)磷酸化ABA受体PYLs负向调控ABA信号,保证植物的正常生长发育;在干旱胁迫下,ABA直接抑制CIPK1与PYLs之间的互作,有活性的ABA受体传递干旱信号,保障植物渡过干旱逆境。这种Ca~(2+)信号对ABA信号的反馈调节机制在植物平衡生长与适应环境中发挥着重要作用,研究成果为作物抗旱育种奠定了理论基础。