作为植物抵御病原微生物侵袭的主要免疫反应之一,活性氧迸发(Reactive oxygen species burst,ROS burst)不仅可以直接杀死病原微生物,还可以作为信号分子诱导气孔关闭和系统获得抗性等其他免疫反应。因此,解析植物体内ROS迸发的机制具有重要意义。自从上个世纪八十年代,人们已发现无毒菌株侵染植物后可诱导双相ROS的迸发:第一相ROS迸发呈现迅速而短暂的动态,第二相ROS迸发则呈现缓慢而持久的动态。近几年对于第一相ROS迸发的分子机制研究已取得了很大进展,但对于持续型ROS迸发还知之甚少。本研究针对持续型ROS迸发的时空动力学进行了深入研究,主要结果如下:1、无毒菌株、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)和中链脂肪酸(3-OH-C10:0)诱导双相ROS迸发。利用鲁米诺化学发光法对无毒菌株、LPS以及3-OH-C10:0诱导的ROS迸发动态进行实时监测对比,发现三者均能诱导第二相持续型ROS的迸发,但LPS诱导产生的第二相ROS强度最大且持续时间最长。鉴于此,我们首先通过正向遗传学手段筛选了LPS处理后第二相持续型ROS迸发缺陷的突变体delt(Defective in LPS-triggered late-ROS),并对其中一个典型突变体delt4展开具体研究。2、APX1突变影响了鲁米诺化学发光法检测第二相持续型ROS迸发。通过图位克隆和Mut Map测序技术相结合的方式,我们鉴定到DELT4基因编码的是胞质抗坏血酸过氧化物酶1(Ascorbate peroxidase 1,APX1)。同时,基于鲁米诺化学发光法检测发现,APX1不仅是LPS诱导的长期鲁米诺发光所必需的,也是3-OH-C10:0和无毒菌株触发产生的持续型鲁米诺发光所必需的。3、APX1突变导致胞内ROS积累。已知APX1是清除胞内过量ROS的主要抗氧化酶,理论上其突变会导致胞内ROS积累,但这与鲁米诺化学发光法检测所得结论相矛盾。因此,在确认APX1的功能缺失并未导致其他抗氧化酶表达上调,也并未造成叶绿体严重受损,以及并不影响呼aquatic antibiotic solution吸爆发氧化酶同源蛋白D(Respiratory burst oxidase homolog D,RBOHD)的持续型激活和积累后,我们又借助3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-Diaminobenzidine,DAB)染色法进行了进一步检测,结果发现,APX1突变显著增强了胞内ROS积累。4、APX1具有催化鲁米诺氧化发光的能力。DAB染色与鲁米诺化学发光法相悖的检测结论暗示APX1可能是催化鲁米诺化学发光反应所需要的酶。基于体外和体内的鲁米诺-ROS化学发光反应检测,我们发现APX1除了以抗坏血酸作为经典底物行使清除胞质ROS的功能外,还具有催化鲁米诺氧化发光的能力。而模拟辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)版本即APX1~(W41F)也进一步增强了其对鲁米诺的催化活性。因此APX1可作为一种类似于HRP的过氧化物酶,在体内外催化鲁米诺和ROS的化学发光反应。5、持续型ROS最终在细胞质内积累。APX1可作为鲁米诺的胞内催化剂购买Liraglutide监测持续型ROS迸发动态,这暗示着持续型ROS可能Adezmapimod采购最终定位于细胞质。借助不同的荧光探针进行观察发现:无毒菌株处理植物后,ROS首先在质外体产生,而在6 h后会逐渐在胞内出现,最终在胞内积累增强。因此植物免疫反应中持续型ROS最终积累于胞内。综上所述,本研究在探索APX1在鲁米诺化学发光体系中的新催化活性的基础上,进一步揭示了持续型ROS最终在胞质内积累,这为RBOHD介导的质外体ROS信号进入胞内提供了重要的空间动力学依据。