缺血性心脏病是全球高发的、高死亡率的心血管疾病,其中,缺血引发的急性心肌梗死(AMI)在该疾病死亡病例中占很大比例。AMI主要是由于缺血缺氧使大量的心肌细胞死亡并形成不可逆的瘢痕组织,从而损害心脏的功能。心肌是高耗氧、高耗能组织,线粒体对心肌细胞的缺血性耐受和死亡具有至关重要的作用,而线粒体动力学(分裂与融合)和线粒体自噬是影响线粒体功能的重要因素。目前,关于线粒体动力学和线粒体自噬如何通过相互作用共同调控心梗期间的心肌细胞耐受或存活还鲜有报道。本实验室之前的研究发现,鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)在缺血心肌细胞中具有维持线粒体功能和促进线粒体自噬的作用,其详细的分子机制有待进一步研究。基因组学分析结果显示,SPC可引起缺血心肌细胞中一种含MORN(膜占位和识别联结小体)结构域的蛋白MORN4显著上调,但目前MORN4在心肌细胞中的作用尚不清楚。本论文分别以缺氧培养的原代小鼠心肌细胞(NMCMs)、原代大鼠心肌细胞(NRCMs)和血清剥夺(SD)的H9c2细胞为体外心肌缺血细胞模型,以小鼠心脏左前降支结扎建立的急性心梗作为体内心肌缺血动物模型,研究了 SPC通过MORN4影响心肌细胞线粒体动力学和线粒体自噬以及保护缺血心肌细胞的分子机制。首先,我们检测了急性心梗小鼠心脏中MORN4的表达情况,结果显示左前降支结扎后7天收集的小鼠梗死心肌中MORN4 水平显著上升。利用尾静脉注射慢病毒包装的MORN4 shRNA获得MORN4敲低小鼠并对其进行心脏彩超分析,发现MORN4敲低加剧了心梗小鼠的心脏损伤。体外实验结果与体内实验一致,即缺氧/SD处理也促进了心肌细胞中MORN4水平上调,敲低MORN4表达后加剧了缺血心肌细胞的凋亡。通过线粒体完整性检测等手段,发现MORN4敲低加剧缺血心肌细胞线粒体功能破坏。利用免疫荧光和透射电镜检测线粒体自噬及线粒体动力学指标的变化,发现MORN4还具有增强缺血心肌细胞线粒体自噬和引起线粒体动力学改变等作用。为了阐明MORN4促进缺血心肌细胞线粒体自噬并引起线粒体动力学改变的分子机制,我们对MORN4的相ventriculostomy-associated infection互作用蛋白进行了质谱分析,并对其中参与线粒体自噬和线粒体动力学改变的MFN2进行重点研究。在利用MORN4敲低和过表达等方法确定了MORN4可上调MFN2表达水平的基础上,进一步通过免疫共沉淀和GST pull-down等方法验证了 MORN4能通过直接靶向MFN2而激活缺血心肌细胞的线粒体自噬和引起线粒体动力学变化。由于MFN2的功能与其磷酸化水平有密切关系,在检测到MORN4具有激活MFN2磷酸化的作用后,利用MFN2磷酸化位点突变质粒和MFN2敲除细胞系等研究工具,通过免疫荧光、免疫沉淀和线粒体分离等研究手段,证明MORN4通过与ROCK2的结合间接激活MFN2 Ser442磷酸化过程,从而引起线粒体动力学依赖性的线粒体自噬,抑制缺血心肌细胞的凋亡。为了进一步明确SPC对MORN4的调控作用,本研究通过免疫印迹和细胞化学等手段证明了 SPC能够促进缺血心肌细胞中MORN4的表达,而MORN4敲低则降低了SPC对损伤线粒体的修复作用和对缺血心肌的保护作用。此外,对心梗小鼠心脏功能指标及缺血心肌细胞中凋购买CP-456773亡指标进行检测后发现,SPC能缓解因抑制MORN4表达所造成的线粒体功能损伤从而抑制细胞凋亡,尾静脉注射SPC还可以缓解因MORN4敲低加重的心梗心脏损伤,表明SPC可作为MORN4的上游因子,通过MORN4调控线粒体功能等途径,挽救缺血心肌细胞。MORN4的功能与其细胞内的定位有关,我们以高尔基体、线粒体荧光探针为工具,结合高尔基体和线粒体分离手段,探究了 MORN4在心肌细胞内的定位与功能之间的关系以及SPC对MORN4调控作用的其他可能机理,发现正常条件下MORN4在H9c2细胞内弥散分布,而在SD刺激下,SPC促进MORN4定位于高尔基体。通过构建包含不同Motif区域的MORN4截短质粒,进一步确定了 MORN4依赖于motif 3结构域定位高尔基体。通过对motif 3结构域的修饰位点进行分析并构建MORN4点突变和结构缺失质粒,发现MORN4通过SUMO interaction motif(SIM)的SUMO-1修饰定位高尔基体。为了阐明MORN4如何发生SUMO-1修饰,我们对常氧/SD H9c2细胞的转录组学数据和MORN4互作蛋白中具有SUMOylation修饰能力的关键因子进行了筛选,结合免疫沉淀和免疫荧光等手段,确定了 E3 SUMO连接酶Ranbp2通过与MORN4的相互作用激活MORN4的SUMO-1修饰,而SPC能够上调Ranbp2来提高MORN4的SUMO-1修饰水平和高尔基体定位。此外,我们发现MORN4与MFN2的直接结合还导致MORN4间接定位于线粒体。本研究通过免疫荧光和透射电镜手段检测了高尔基体和线粒体在缺氧NRCMs/SDH9c2细胞的膜距离,最终证实MORN4与MF获悉更多N2的结合还介导了高尔基体-线粒体膜接触,表明MORN4的高尔基体定位可能是其对缺血心肌细胞发挥保护功能的原因。以上研究结果表明,MORN4可能是一种缺血性心肌损伤的内源性保护因子,通过促进MFN2 Ser442磷酸化,从而通过激活心肌细胞线粒体动力学和线粒体自噬改变等方式抵抗缺血心肌细胞凋亡。SPC在心肌缺血情况下能够作为MORN4的激动剂,通过促进MORN4的表达、MORN4在高尔基体上的募集和定位以及介导高尔基体-线粒体膜接触等方式来激活MORN4的保护作用。本研究结果初步阐明了 MORN蛋白对缺血性心肌损伤具有保护作用的机理,为通过调节线粒体动力学平衡来提高心肌对缺血的耐受性和防治急性心肌梗死等研究提供了新的视角和思路。