DNA碱基编辑器(Base editor,BE),主要包括胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE),是衍生于CRISPR/Cas9(Clustered regularlyGSK J4试剂 interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统的新型基因编辑工具。通过将Cas9切口酶(Nickase)与胞嘧啶(APOBEC/AID家族)或者腺嘌呤碱基脱氨酶(经进化的Tad A蛋白)融合,BE可以在sg RNA的引导下在基因组特定位点进行碱基的脱氨反应,将胞嘧啶或腺嘌呤分别转换为胸腺嘧啶和鸟嘌呤。碱基编辑器在不引入DNA双链断裂且不需要额外的DNA供体模板的前提下,能高效催化碱基替换,展现出广泛的应用前景。ABE可将A·T碱基对转换为G·C碱基对,但如果靶点的编辑窗口(碱基编辑器在靶点内脱氨的碱基范围)内有多个腺嘌呤,会由于旁观者效应引起非目的碱基的转换,而且ABE的DNA和RNA水平的脱靶编辑引起了大家对其安全问题的广泛关注。最近也有报导意外发现ABE会对基因组DNA中的TCN基序产生胞嘧啶脱氨活性,导致在编辑窗口内除了引起A-toG的旁观者效应还会出SB203580现C-to-T/A/G的胞嘧啶碱基编辑。随着ABE的不断改进,在其活性增加的同时(例如antiseizure medications超高活性的ABE8e)也带来了更严重的腺嘌呤和胞嘧啶旁观者效应、更高的DNA和RNA脱靶编辑。因此,开发更加安全且高效的ABE是解决碱基编辑临床应用安全性问题的迫切需要。在本课题中,我们基于Tad A-8e腺嘌呤脱氨酶的冷冻电镜结构,通过尝试修改脱氨酶中影响与底物DNA相互作用的十个关键残基(E27、V28、P29、H57、F84、P86、N108、L145、F148以及Y149),设计并构建21个不同单个氨基酸替换的突变体。通过初步筛选,我们发现Tad A-8e-V28F、V28N、N108Q、L145C、L145T和L145Q在不降低on-target编辑活性的情况下,相比于ABE8e呈现出缩窄窗口和降低胞嘧啶碱基转换的趋势,其中ABE8e-N108Q活性最高且旁观者编辑效应最低。通过在细胞内12个含有多个腺嘌呤和9个胞嘧啶的内源性靶点测试,我们证明ABE8e-N108Q相较于ABE8e在保持主要编辑活性的同时可将主要活性窗口缩窄至A4-A7位,并可以将胞嘧啶旁观者编辑效率从平均18.02%减少至平均5.79%。然而,该变体在降低腺嘌呤和胞嘧啶旁观者编辑的表现不够完美,无法实现真正意义上的单碱基编辑。因此,我们想进一步叠加潜在能够提升脱氨酶特异性的点突变,开发窗口缩窄的ABE。在初步的筛选中,我们构建了14个组合突变体,发现ABE8e-N108Q与E27、P29、F84和L145突变残基的结合呈现出紧缩的窄窗口,仅仅编辑A5位。其中ABE8e-N108Q/L145T在维持高on-target活性同时展现出最窄的编辑窗口,我们因此将其命名为ABE9。在12个含有多个腺嘌呤的内源性靶点测试结果表明,ABE9整体编辑活性相对于ABE8e轻微降低,但其编辑活性远高于ABE7.10,可以显著降低腺嘌呤旁观者编辑,将活性窗口缩窄至1-2nt,编辑精确度相对于ABE8e-N108Q最高提升8倍(平均4.3倍)。ABE9的indels引入率相比于ABE8e和ABE8e-N108Q持平或略微降低。此外,在11个含有多个胞嘧啶的内源性靶点的测试中,ABE8e和ABE8eN108Q在所有靶点都产生严重的胞嘧啶旁观者编辑,而ABE9在10/11的靶点中没有胞嘧啶的编辑(<1%视为不存在编辑),相对于ABE8e和ABE8e-N108Q将胞嘧啶转换比率分别降低平均56.2倍和10.2倍,证明ABE9几乎完全消除非必要的胞嘧啶编辑。此外,利用含有9120条sg RNA的靶点文库无偏见评价策略,我们发现相对于ABE8e(A4-A9)和ABE8e-N108Q(A4-A7)的宽编辑窗口,ABE9将编辑窗口缩窄至1-2nt,在A5位活性和偏好性最高。通过编辑背景序列偏好性分析,发现ABE9在编辑时对DNA靶点背景序列无依赖性。这都表明ABE9的精准脱氨与碱基在靶点中的相对位置有关系而不是靶点的背景序列。另外,经44个g RNA依赖的DNA潜在脱靶位点分析,ABE8e在11个测试的位点诱导轻度脱靶编辑(平均4.15%),而ABE9在保持高活性的同时只在2个位点产生轻微的脱靶。在增强正交R-loop实验中,ABE9相较于ABE8e极大降低了Cas9非依赖的DNA脱靶,其DNA脱靶活性降低到接近背景水平(平均<0.3%)。在全基因组RNA-seq分析中,ABE9的RNA脱靶效应也降低至背景水平,与ABE8e和ABE8e-N108Q相比分别降低了726.1倍和117.1倍。这些结果表明,ABE9高度特异,仅引入比率极低的DNA和RNA脱靶编辑。由于编辑窗口紧缩,ABE9可融合到具有广泛PAM(Protospacer adjacent motif,PAM)兼容性的Cas9变体,进一步扩大精确校正致病性点突变的范围。总而言之,本研究通过定向改造腺嘌呤脱氨酶Tad A-8e开发出了一种新型精准安全的ABE9,其具备1-2nt的窄窗口,能够在哺乳动物细胞中精准实现A-toG转换,消除了传统ABE存在的严重胞嘧啶旁观者效应并大幅降低不可预测的脱靶编辑,为基础研究和基因治疗提供新的精准编辑研究工具。