研究背景与目的:糖尿病慢性伤口如糖尿病足、糖尿病性溃疡等难以愈合,主要原因是慢性炎症和血管新生异常等,目前临床上仍缺乏的有效的治疗策略。外泌体是由细胞分泌的囊泡样小体,具有磷脂双层膜结构,携带蛋白质、核酸和脂质等信号分子介导细胞间通讯,在多种生理和病理发生发展的过程中发挥着重要作用,具有作为药物或药物载体的潜力。间充质干细胞(MSCs)具有强大的组织器官修复能力,其来源的外泌体在多种疾病损伤模型中取得了良好的治疗效果,然而天然来源的外泌体中抗炎和促血管新生的成分比较有限。研究证明,miR-126参与炎症的调节并且具有促进血管生成的作用,但在体内不稳定很容易被降解。近十年以来,外泌体有关的研究呈mid-regional proadrenomedullin指数级增长,而外泌体相关的临床试验却很少,这其中很大的一个挑战是外泌体的产量很低,难以满足临床的需求。因此,本论文研究旨在构建装载miR-126的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)来源的外泌体并研究其在糖尿病创面愈合中的作用,并初步探索提高外泌体产量的方法。研究方法与结果:1.原代hUC-MSCs的提取和鉴定本研究采用组织块贴壁法提取hUC-MSCs,并分别通过光学显微镜、流式细胞术、三系分化实验对提取的原代hUC-MSCs进行鉴定。结果表明,提取得到的hUC-MSCs具有良好的黏附贴壁特性,阳性标志物CD105、CD90和CD73的表达量均高于99%,阴性标志物CD34和CD45的表达量分别为0.28%和0.09%,在体外诱导下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。2.工程化外泌体(E-Exos)的制备与鉴定本论文研究采用差速超速离心法结合切向流超滤从hUC-MSCs条件培养基中提取外泌体,用电转的方式将miR-126导入其中,透射电镜下观察其形态,用纳米颗粒追踪分析技术测定其粒径分布,通过蛋白质免疫印记法鉴定其标志蛋白,用RT-qPCR测定miR-126装载率。结果显示,外泌体呈一侧凹陷的半球形,粒径分布在130 nm左右,高表达CD63、CD81和肿瘤易感基因101蛋白质(TSG101),低表达钙连蛋白(calnexin)。电穿孔前后外泌体的形态、大小和标志蛋白无显著变化,E-Exos中miR-126的含量是Exos 的 1.63 倍。3.E-Exos促糖尿病创面愈合的作用研究用db/db糖尿病小鼠构建夹板全层皮肤切除模型,拍照记录伤口愈合过程中伤口的大小,并通过H&E、Masson和免疫荧光染色评价E-Exos促糖尿病小鼠皮肤创面愈合的作用。结果显示E-Exos能够显著促进伤口的闭合、表皮的生长及胶原的沉积,并能够显著促进血管的新生。4.提高外泌体产量的初步探索本研究用慢病毒颗MRTX1133纯度粒感染hUC-MSCs,构建荧光蛋白EGFP和外泌体标志蛋白CD63融合表达的EGFP-CD63-MSCs,使其分泌的外泌体自发荧光,通过培养上清液中荧光值的大小表征外泌体的分泌量。通过此高通量筛选系统筛选外泌体激动剂,结果表明去甲肾上腺素、N-甲基多巴胺、非诺特罗、甲酚甘油醚和毛喉素能够促进hUC-MTofacitinib说明书SCs外泌体的分泌,其中去甲肾上腺素和N-甲基多巴胺效果最为明显,能够使hUC-MSCs外泌体的分泌量提高到2倍。研究结论:1.成功构建了基于hUC-MSCs来源外泌体的miRNA递送系统,并在体内水平证明导入miR-126的E-Exos能够通过血管新生、表皮再生、肉芽组织形成、细胞外基质重塑等方面促进糖尿病皮肤伤口愈合。2.成功构建了一种基于荧光的外泌体激动剂高通量筛选系统,筛选得到5种hUC-MSCs外泌体激动剂,其中去甲肾上腺素和N-甲基多巴胺效果最为显著,能够使hUC-MSCs外泌体的分泌量提高到2倍。