中国正面临着严峻的耕地土壤重金属污染问题,其中镉(Cadmium)元素对于粮食作物的生长发育产生极大的威胁,已经成为影响粮食安全生产的重大难题,特别是对于小麦等主要作物的影响尤为显著。因此,研究小麦中镉的吸收、运输和外排的分子机制,创造可以在籽粒中低镉积累的小麦优Cobimetinib抑制剂质品种,对保障我国粮食以及食品安全具有重要意义。本实验采用RT-PCR方法克隆出小麦镉胁迫相关基因Ta NRAMP5,并对其进行生物信息学分析。用q RT-RCR分析镉胁迫下Ta NRAMP5基因的表达水平和组织表达模式,构建Ta NRAMP5基因的酵母表达载体p YES2.0-Ta NRAMP5,在酵母突变体Δycf1中解析基因功能。同时利用过表达技术在烟草和小麦中验证Ta NRAMP5基因在镉胁迫条件下的表型及功能,分析Ta NRAMP5基因在小麦镉胁迫过程中的分子调控作用机理,为创制耐镉、籽粒低积累镉的小麦优质品种奠定研究基础。利用酵母杂交系统筛选酵母文库中与Ta NRAMP5的互作蛋白,并从筛选出的蛋白中扩增出蛋白磷酸酶基因,在酵母细胞和烟草植物细胞中验证Ta NRAMP5与蛋白磷酸酶之间的互作关系。为进一步研究小麦耐镉机制的研究以及耐镉基因资源的挖掘奠定坚实的理论基础。主要研究结果如下:1.利用RT-PCR技术,扩增Ta NRAMP5基因全长,并进行生物信息学分析。结果表明该基因ORF长为1623 bp,编码540个氨基酸,分子量大小58.52 k Da,等电点6.85,为稳定蛋白,具有11个明显的跨膜结构域,为疏水性蛋白。进化树分析结果表明小麦Ta NRAMP5与波兰小麦、葡萄、蔷薇的蛋白亲缘关系最近。2.利用q RT-PCR技术分析Ta NRAMP5基因在镉胁迫下的表达水平和组织表达模式。结果表明,在正常情况下,Ta NRAMP5在不同组织部位中都有表达,在幼叶、茎秆和旗叶中表达水平较高,在幼根和雌蕊中表达水平较低。随着镉胁迫处理时间的延长,Ta NRAMP5基因表达量逐渐升高,6h时达到最高,然后其表达量逐渐降低,呈现先增高后降低的趋势。表明Ta NRAMP5基因能够参与镉胁迫响应,与小麦镉离子的吸收与转运之间存在密切的联系。3.构建带有GFP标签的Ta NRAMP5基因表达载体,并采用农杆菌介导法使GFP-Ta NRAMP5载体在洋葱内表皮细胞进行瞬时表达,结果显示Ta NRAMP5基因定位在细胞膜上。4.利用在线网站Plant CARE对Ta NRAMP5启动子进行顺式作用元件分析,显示Ta NRAMP5启动子内有多个光响应元件,以及参与植物抗逆性、抗病性Water microbiological analysis和激素反应的顺式作用元件MYB、GC-motif、ABRE、CGTCA-motif。去除p BI121载体中的35S启动子,并构建p BI121-Ta NRAMP5启动子融合载体,利用农杆菌介导法,使Ta NRAMP5启动子在烟草中进行瞬时表达,鉴定Ta NRAMP5基因启动子活性。同时,用0.5mmol/L Cd喷施转化后的烟草叶片。结果表明,经p BI121-Ta NRAMP5启动子表达载体注射的叶片呈现较深的蓝色。表明外源镉处理对Ta NRAMP5启动子的活性有明显的诱导作用。5.将Ta NRAMP5基因在酵母镉敏感性突变体Δycf1中进行表达。结果表明,与转化空载体的酵母相比,转化Ta NRAMP5基因的酵母突变体在含25μmol/L和50μmol/L镉的平板上对镉的耐受性显著增强。在50μmol/L镉处理条件下,转化了Ta NRAMP5基因的酵母生长趋势明显较强。将酵母菌体离心收集,烘干后进行镉含量测定,结果表明,转化Ta NRAMP5基因的酵母突变体菌株镉含量显著低于转化空载体的酵母菌株,降低了25.18%,表明Ta NRAMP5基因的表达会提高酵母对镉的耐受性,并降低酵母细胞中镉离子浓度。6.为了更加深入研究Ta NRAMP5基因功能,利用过表达技术在烟草中对Ta NRAMP5基因进行功能验证。通过对其进行短时间镉胁迫处理,并分析表型发现,Ta NRAMP5过表达株系与对照相比,转基因株系的株高、总根长与WT植株之间并无明显差异。但经长时间Cd胁迫后,转基因株系叶片叶绿素含量明显高于WT植株,对Cd耐受能力更高。且过表达Ta NRAMP5基因的烟草地下部分的镉含量显著高于野生型烟草,而地上部分中的镉元素含量显著低于野生型烟草。7.通过构建Ta NRAMP5基因过表达载体并转化到小麦中,利用GUS标签基因染色筛选获得阳性植株,并进行耐镉性分析。结果表明,Ta NRAMP5过表达植株在株高、根长、籽粒大小等与WT植株并无明显差异。但过表达Ta NRAMP5能够显著降低小麦茎节、叶片、叶鞘及籽粒的镉离子含量。8.为了更加深入研究Ta NRAMP5基因在小麦镉胁迫中的功能,采用酵母双杂交技术对Ta NRAMP5基因进行互作蛋白筛选,得到11个可能与Ta NRAMP5互作的蛋白。经Blast比对筛选获得5个与植物抗逆、抗病、抗氧化等相关的基因,分别为Ta MYB61,甘油醛-3-磷酸脱氢酶B,UP-葡萄糖糖基转移酶BX8,蛋白磷酸酶,以及细胞周期蛋白。利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术在酵母和烟草中进一步验证互作关系,发现蛋白磷酸酶与Ta NRAMP5在酵母细胞及烟草细胞中均存在互作关系。以上结果表明Ta NRAMP5基因定位在植物细胞膜上,是一种膜转运蛋白。在烟草中过表达Ta NRAMP5基因后显著降低了镉Gefitinib采购在根以及地上器官中的含量。在小麦中过表达Ta NRAMP5基因后与对照组相比,表型无明显差异,但显著降低了小麦地上部分茎节、叶片、叶鞘及籽粒的镉含量,表明Ta NRAMP5基因参与小麦对镉的吸收和转运及积累过程。此外,我们还利用酵母双杂交技术筛选酵母文库挖掘得到了Ta NRAMP5基因的11个互作蛋白,并选取蛋白磷酸酶在酵母细胞及烟草细胞中与Ta NRAMP5进行了互作验证。为解析Ta NRAMP5基因在重金属吸收、转运、积累、输出方面的遗传调控网络,以及培育耐镉、低镉积累的小麦品种提供了理论基础和遗传资源。