急性肾损伤(AKI)是临床上一种常见的综合征,具有较高的死亡率和进展为慢性肾脏病和终末期肾病的的风险,肾毒性药物是AKI发生的常见原因。阿霉素(ADM)是临床上治疗恶性肿瘤时经常使用的化疗药物,但伴随着诸多的副作用,肾毒性是其化疗过程中严重不良反应之一,虽然ADM介导的肾毒性的基本过程仍然不清楚,但有证据表明,这与氧化应激和凋亡有关。ADM发挥疗效的同时也伴随着胃肠道不良反应,在临床上广泛与质子泵抑制剂(PPIs)联用以此缓解其导致的胃肠道不良反应。研究发现,PPIs也可导致肾脏损伤,并且PPIs肾毒性的分子机制可能与线粒体损伤有关。线粒体是产生活性氧(ROS)的主要场所,ROS在维持细胞内外环境的稳定和信号传导中起到重要的作用,当线粒体的功能受到损坏时,蓄积的ROS会反过来进攻失调的线粒体来加重线粒体的损伤,形成恶性循环。同时细胞内过量的ROS导致氧化应激,部分ROS可诱导核因子κB的活化,激活凋亡相关信号通路,造成细胞凋亡,导致疾病的发生。目前,PPIs对ADM诱导的肾损伤的影响,作用机制如何,尚不清楚。因此,本课题拟在已有临床报道的基础上,通过建立ADM大鼠肾损伤模型,考察PPIs对ADM肾毒性的影响,初步探究F_1F_0-ATPase介导的线粒体氧化应激途径对此过程肾脏细胞凋亡的作用,为临床合理用药提供一定的实验依据。目的:1.明确奥美拉唑对阿霉素诱导的Wistar大鼠肾损伤的影响;2.揭示奥美拉唑通过F_1F_0-ATPase介导的线粒体氧化应激途径,增加肾脏细胞凋亡,进而加重对阿霉素诱导的大鼠肾毒dental pathology性的初步机制。方法:1.建立阿霉素诱导的大鼠肾损模型,在造模成功后使用奥美拉唑干预42天,然后收集大鼠血液制备血清和24h尿液后处死,收集所有大鼠肾脏。检测各组大鼠肾功能指标(血清肌酐和内生肌酐清除率)、肾脏病理改变、肾细胞凋亡(TUNEL染色)。检测大鼠肾脏氧化应激指标(GSH和MDA),使用微量法检测大鼠肾脏F_1F_0-ATPase活性,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测凋亡相关蛋白表达和p-P65表达情况,探究奥美拉selleck Dinaciclib唑对阿霉素诱导的轻微肾损大鼠模型的作用。2.CCK-8法检测不同浓度奥美拉唑和阿霉素刺激NRK-52E细胞不同时间对细胞增殖活性的影响,筛选出奥美拉唑和阿霉素刺激NRK-52E细胞的最佳浓度和时间。3.流式细胞术测定奥美拉唑和阿霉素联用对NRK-52E细胞凋亡的影响,同时使用WB检测奥美拉唑和阿霉素联用对NRK-52E细胞凋亡相关蛋白表达和p-P65表达的影响,然后使用比色法和荧光探针法检测奥美拉唑和阿霉素联用对NRK-52E细胞线粒体功能的影响。4.使用Discovery Studio 2019 Client软件对奥美拉唑和F_1F_0-ATPase进行分子对接,观察奥美拉唑和F_1F_0-ATPase能否直接相互结合。以F_1F_0-ATPase专属抑制剂寡霉素为阳性对照药组,使用微量法检测奥美拉唑、寡霉素、阿霉素对NRK-52E细胞F_1F_0-ATPase活性的影响,然后使用比色法和荧光探针法检测奥美拉唑和寡霉素分别联用阿霉素对NRK-52E细胞线粒体功能变化和ROS蓄积情况,以及使用流式细胞术测定NRK-52E细胞凋亡的影响,探究奥美拉唑通过对F_1F_0-ATPase的调控影响线粒体功能对阿霉素引起的ROS蓄积和细胞凋亡的作用。5.使用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)清除奥美拉唑和阿霉素联用导致NRK-52E细胞ROS蓄积,使用流式细胞术测定NRK-52E细胞的凋亡率,然后WB检测NRK-52E细胞凋亡相关蛋白的表达和p-P65表达情况,以及使用比色法和荧光探针法检测NRK-52E细胞线粒体功能变化情况,探究ROS/NF-κB在奥美拉唑和阿霉素联用导致细胞凋亡的作用。结果:1.奥美拉唑对阿霉素诱导的肾损大鼠模型的作用结果表明,阿霉素造模第14天,与正常大鼠相比,阿霉素诱导大鼠的尿蛋白显著升高、血清肌酐显著升高、内生肌酐清除率明显降低,表明造模成功。第56天,与正常大鼠相比,阿霉素诱导的大鼠的血清肌酐增长倍数显著升高,与阿霉素组相比,联合给药组(奥美拉唑和阿霉素联合给药)大鼠的血清肌酐增长倍数显著升高。同时,阿霉素诱导和联合给药组大鼠的肌酐清除率显著降低,与阿霉素组相比,联合给药组大鼠的肌酐清除率显著降低。病理结果表明,各药物组大鼠肾更多脏均出现了组织病理改变,与正常组相比,阿霉素组大鼠肾小球出现系膜增生,肾小管上皮细胞形成空泡并脱落形成胶样蛋白管型,肾间质出现多灶型炎性细胞浸润的情况,联合给药组大鼠除了具有阿霉素组的病理学特征之外,还出现了明显的肾小管扩张和肾间质水肿新的病理特征。TUNEL染色结果显示,正常组大鼠的肾组织未见明显绿色荧光点,奥美拉唑组有细微的绿色荧光点亮点,阿霉素组出现较多的绿色荧光点亮点,而联合给药组的绿色荧光亮点进一步增加;绿色荧光颗粒在肾组织中的分布大致呈环状,绿色荧光分布主要集中在肾小管上皮细胞核。WB结果显示,与正常组相比,奥美拉唑组和阿霉素组Bax/Bcl-2比值显著升高,与阿霉素组相比,联合给药组Bax/Bcl-2比值显著升高;与正常组相比,阿霉素组Cyt C、Cleaved caspase 8表达水平显著升高,与阿霉素组相比,联合给药组Cyt C、Cleaved caspase8表达水平显著升高。奥美拉唑抑制肾组织F_1F_0-ATPase活性和降低ATP含量,奥美拉唑和阿霉素均可以导致肾脏脂质过氧化损伤,与阿霉素组相比,联合给药组诱导的大鼠肾脏脂质过氧化损伤加重。奥美拉唑和阿霉素均可以导致肾脏组织p-P65表达水平升高,与阿霉素组相比,联合给药组大鼠肾脏组织p-P65表达水平水平升高。2.奥美拉唑和阿霉素刺激NRK-52E细胞最佳浓度和时间的选择结果显示,选择奥美拉唑20μM作为常规干预浓度,该药物浓度对NRK-52E细胞活性影响不大且与患者体内药物浓度相一致,选择阿霉素0.1μM作为造模浓度,在此浓度下NRK-52E细胞活性下降30%左右、刺激时间为24h符合实验目的。3.奥美拉唑和阿霉素对NRK-52E细胞凋亡、线粒体功能、ROS蓄积和NF-κB活化的影响Annexin V/PI双染法和WB结果显示,与Control组相比,ADM组和OPZ+ADM组细胞凋亡率均显著升高;与ADM组相比,OPZ+ADM组细胞凋亡率显著升高。与Control组相比,OPZ组、ADM组和OPZ+ADM组Bax/Bcl-2比值显著升高,ADM组和OPZ+ADM组Cyt C表达水平显著升高,OPZ+ADM组Cleaved caspase8表达水平显著升高;与ADM组相比,OPZ+ADM组Bax/Bcl-2比值、Cyt C、Cleaved caspase 8表达水平均显著升高。比色法结果显示,与Control组相比,OPZ组、ADM组和OPZ+ADM组ATP含量均显著下降;与ADM组相比,OPZ+ADM组细胞ATP含量显著下降。荧光探针(JC-1)法结果显示,OPZ组、ADM组和OPZ+ADM组细胞的线粒体膜电位(MMP)相对于Control组明显降低;与ADM组相比,OPZ+ADM组MMP明显降低。荧光探针(DCFH-DA)法结果显示,与Control组相比,OPZ组、ADM组和OPZ+ADM组细胞的ROS释放显著增加;与ADM组相比,OPZ+ADM组细胞的ROS释放量显著增加。WB结果显示,与Control组相比,OPZ组、ADM组和OPZ+ADM组p-P65表达水平均显著升高;OPZ+ADM组p-P65表达水平高于ADM组。4.奥美拉唑对NRK-52E细胞的F_1F_0-ATPase活性的调控和对线粒体功能的作用及影响分子对接结果显示,OPZ与F_1F_0-ATPase能直接相互结合,选取最优分子构象,CDOCKER能量值为-24.5262对接体系总能量低、体系稳定,CDOCKER结合能量值为-44.2139,对接过程中受体和配体相互作用小,两者结合得较好。微量法结果显示,与Control组相比,F_1F_0-ATPase专属抑制剂Oligomycin组、OPZ组、OPZ+ADM组和Oligomycin+ADM组细胞F_1F_0-ATPase活性显著降低。结果显示,OPZ在一定程度上能够抑制F_1F_0-ATPase活性。比色法结果显示,与ADM组相比,OPZ+ADM组和Oligomycin+ADM组细胞ATP含量显著降低。荧光探针(DCFH-DA)法结果显示,与ADM组相比,OPZ+ADM组和Oligomycin+ADM组细胞的ROS的释放显著增加。荧光探针(JC-1)法结果显示,与ADM组相比,OPZ+ADM组和Oligomycin+ADM组细胞的MMP明显降低。Annexin V/PI双染法结果显示,与ADM组相比,OPZ+ADM组和Oligomycin+ADM组细胞凋亡率均显著升高。5.NAC对奥美拉唑和阿霉素联用刺激NRK-52E细胞ROS/NF-κB凋亡通路和线粒体功能的影响。Annexin V/PI双染法结果显示,与Control组相比,OPZ+ADM组细胞凋亡率显著升高;与OPZ+ADM组相比,NAC+OPZ+ADM组细胞凋亡率显著降低。WB结果显示,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C、Cleaved caspase 8表达水平结果与流式结果相一致;与Control组相比,OPZ+ADM组p-P65表达水平显著升高,与OPZ+ADM组相比,NAC+OPZ+ADM组p-P65表达水平显著减少。荧光探针法结果显示,与Control组相比,OPZ+ADM组细胞ROS释放显著增加;与OPZ+ADM组相比,NAC+OPZ+ADM组细胞的ROS释放量明显减少;与Control组相比,OPZ+ADM组细胞的MMP明显降低,与OPZ+ADM组相比,NAC+OPZ+ADM组MMP明显升高。结论:1.奥美拉唑加重了阿霉素诱导的Wistar大鼠肾毒性;2.奥美拉唑可以通过F_1F_0-ATPase介导的线粒体氧化应激途径,增加肾脏细胞凋亡,进而加重对阿霉素诱导的大鼠肾毒性。