目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种主要发生于中枢神经系统的自身免疫脱髓鞘性疾病。全球有超过两百万人罹患此病,患者主要为年轻女性。其典型病理特征是中枢神经系统局灶性脱髓鞘性斑块,轴突损伤和星形胶质细胞增生等。MS患者的临床表现多样,病因尚未完全明确。目前的治疗手段无法治愈MS,常用的治疗药物,如富马酸二甲酯等,被报道具有一定的副作用。炎性小体是一种多分子信号复合体,可以感受损伤和压力信号,促进促炎细胞因子的成熟和分泌。其中,NLRP3炎性小体是目前研究最为广泛的炎性小体。研究表明,NLRPImmune landscape3炎性小体参与多种免疫炎症性疾病,并且在中枢神经系统疾病中也有相关报道。炎性小体的激活可以介导焦亡发生,这是一种程序性细胞死亡,在MS中起到重要作用。作为脑内关键的免疫细胞,小胶质细胞在MS中也发挥着重要作用。大黄素是一种来源于大黄等草本植物的天然产物,具有抗炎和抗氧化等多种作用。目前的研究发现,大黄素对于中枢神经系统疾病具有神经保护作用。本研究采用实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠模型—一种经典的MS动物模型,初步探讨大黄素对于EAE的神经保护作用,以及在这一过程中涉及到的潜在作用机制。研究方法:一建立EAE大鼠模型及小胶质细胞炎症模型,探究大黄素对于EAE大鼠模型的神经保护作用,以及对小胶质细胞炎症的抑制作用1.建立EAE大鼠模型。从造模日开始,每日腹腔注射大黄素或相应溶剂,直到取材前一天。记录大鼠每日的体重及神经行为学评分;通过HE染色评价脑和脊髓内炎性细胞的浸润程度;通过LFB染色评价脊髓脱髓鞘的程度;q RT-PCR,NO检测和ELISA用于评价炎症相关因子的表达水平;通过免疫组织化NSC 127716说明书学染色评价脊髓内Iba-1和CD68的表达水平。2.建立小胶质细胞的炎症模型。通过CCK8法评价细胞的活力;通过NO检测和ELISA评价炎症相关因子的表达;通过荧光和流式实验检测ROS的水平。二探究大黄素对于EAE大鼠模型和小胶质细胞炎症模型中NLRP3炎性小体及焦亡的影响1.在体内实验中,通过Western blot检测NLRP3,ASC和cleaved-caspase-1的蛋白表达水平;通过q RT-PCR和ELISA检测IL-1β和IL-18的表达水平;通过LDH检测和GSDMD-N的Western blot检测,评价焦亡水平。2.在体外实验中,通过Western blot检测NLRP3,ASC和cleaved-caspase-1的蛋白表达水平;通过ELISA检测IL-1β和IL-18的表达水平;通过LDH检测和GSDMD-N的Western blot检测,评价焦亡水平;通过Calcein-AM/PI染色评价细胞死亡程度。三大黄素影响NLRP3炎性小体和焦亡的机制研究1.通过网络药理学相关技术,预测大黄素影响MS的潜在作用靶点。2.通过分子对接,模拟大黄素与潜在作用靶点的结合;通过Western blot检测体内外实验中,潜在作用靶点的蛋白表达水平。3.在体外实验中,使用siRNA转染小胶质细胞,敲减潜在作用靶点(荧光,q RT-PCR及Western blot用于转染效率的验证);使用靶点抑制剂,抑制潜在靶点的蛋白表达(CCK8法和Western blot用于抑制效率的验证)。通过Western blot检测潜在作用靶点及其下游分子,NLRP3,ASC和cleaved-caspase-1的蛋白表达水平;通过ELISA检测IL-1β和IL-18的表达水平;通过LDH检测和GSDMD-N的Western blot检测,评价焦亡水平。4.在体外实验中,通过使用抑制剂来抑制潜在靶点的下游分子的蛋白表达(CCK8法和Western blot用于抑制效率的验证)。通过Western blot检测潜在作用靶点及其下游分子,NLRP3,ASC和cleaved-caspase-1的蛋白表达水平;通过ELISA检测IL-1β和IL-18的表达水平;通过LDH检测和GSDMD-N的Western blot检测,评价焦亡水平。结果:1.与正常对照组大鼠相比,疾病模型IACS-010759使用方法组大鼠的体重显著减少,神经行为学评分明显升高;脊髓内炎性细胞浸润和脱髓鞘的程度明显增加;脑内炎性细胞浸润的程度显著增加;脊髓组织及血清中炎症细胞因子的表达水平显著升高;脊髓组织内Iba-1和CD68的表达增加。与疾病模型组相比,在大黄素治疗组中,这些指标都有明显的改善。此外,与正常对照组相比,在大黄素对照组中这些指标无显著改变。2.与对照组的小胶质细胞相比,小胶质细胞炎症模型组中促炎因子表达增加,抗炎因子表达减少,ROS水平升高。而大黄素处理后可以显著抑制促炎因子的表达,增加抗炎因子的表达,并且降低ROS的水平。3.与正常对照组大鼠相比,疾病模型组大鼠的脊髓组织内NLRP3,ASC,cleaved-caspase-1和GSDMD-N的蛋白表达显著增加;脊髓组织内IL-1β和IL-18的m RNA的表达明显增加;血清中IL-1β,IL-18和LDH的水平显著升高。在大黄素治疗组中,这些指标的表达水平均显著降低。与正常对照组相比,在大黄素对照组中这些指标无明显改变。4.与对照组的小胶质细胞相比,小胶质细胞炎症模型组的NLRP3,ASC,cleaved-caspase-1和GSDMD-N的蛋白表达明显增加;细胞培养上清液中IL-1β,IL-18和LDH的表达明显增加;细胞死亡程度加重。大黄素处理后可以显著抑制这些指标的增加。5.结合网络药理学的结果和现有文献,SIRT1可能是大黄素影响MS的潜在作用靶点,PGC-1α是SIRT1的可能下游;分子对接结果表明,大黄素与SIRT1之间的结合可能性很大;Western blot的结果显示,在体内外模型组中,SIRT1和PGC-1α的表达水平下降,而大黄素处理之后可以增加它们的表达。6.在体外实验中,使用SIRT1的siRNA转染和抑制剂(EX527)可以显著抑制细胞内SIRT1的表达。与治疗组相比,转染后细胞内SIRT1和PGC-1α的表达水平明显降低,转染组细胞的NLRP3炎性小体和焦亡的相关指标表达显著增加,提示大黄素通过SIRT1调控NLRP3炎性小体活化和焦亡。然而,抑制剂组对于相关指标的影响并不显著。7.在体外实验中,使用PGC-1α抑制剂(SR-18292)可以明显降低细胞内PGC-1α的表达水平。与治疗组相比,抑制剂组细胞的PGC-1α的表达显著减少,但是SIRT1的表达水平并无明显改变,结合前面的结果,提示PGC-1α可能是SIRT1的下游因子;此外,抑制剂组细胞的NLRP3炎性小体和焦亡的相关指标表达显著增加,说明PGC-1α参与了大黄素对NLRP3炎性小体活化和焦亡的调控。因此,大黄素可能是通过SIRT1/PGC-1α途径调控NLRP3炎性小体活化和焦亡。结论:1.大黄素可以改善EAE大鼠模型的临床症状,抑制脊髓内炎性细胞浸润和脱髓鞘的程度,抑制脑内炎性细胞浸润的程度,减轻炎症水平,进而发挥神经保护作用;大黄素可以抑制小胶质细胞炎症模型的炎症水平。2.在EAE大鼠模型和小胶质细胞炎症模型中,大黄素可以抑制NLRP3炎性小体活化和焦亡的水平。3.大黄素通过SIRT1/PGC-1α途径调控NLRP3炎性小体活化和焦亡。