叶片是植物最重要的光合器官,其形态和功能通过影响植物株型、光合、呼吸、蒸腾和养分吸收等决定作物生产力。大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)的叶片既是光合器官,也是主要的产品器官,适当皱缩的叶片可通过提高植株的光能利用效率提高其产量和质量。鉴于突变体是挖掘基因功能的重要材料,本研究采用EMS诱变大白菜DH系‘FT’,获得了3份皱叶突变体cwm、lwm和bwm。利用BSR-Seq和Mut Map方法对突变基因进行定位;根据基因功能注释信息预测候选基因;利用拟南芥异源转化DS-3201溶解度和平行变异分析验证候选基因的功能;采用q RT-PCR技术分析突变基因的表达模式。主要研究结果如下:1.克隆了大白菜叶片皱缩突变基因Brcwm,其编码皮层微管组织相关蛋白TON1。由EMS诱变获得的大白菜突变体cwm(compact wrinkled mutant)叶片皱缩,株型紧凑,植株矮小。遗传分析表明,突变性状由单隐性核基因控制。通过BSR-seq分析,将突变基因Brcwm初步定位在A07染色体上的3个区间以及A05染色体上的1个区间内;进一步利用SSR和Indel标记分析将突变基因锚定到A07染色体上IOncologic emergencyndel 12和Indel21之间205.66kb的区间内,该区间内包含39个基因。鉴于候选区间内已没有可用的分子标记,采用全基因组重测序的方法挖掘SNP变异,结果表明在目标区间内只有Bra A07g021970.3C的第4外显子上有一个由C到T的非同义碱基替换,导致脯氨酸(Pro)替换为丝氨酸(Ser)。共分离验证实验结果表明,突变性状与该SNP共分离,预测Bra A07g021970.3C为候选基因。Bra A07g021970.3C与拟南芥中编码皮层微管组织相关蛋白TON1的AT3G55000是同源基因。在缺失TON1的隐性纯合拟南芥突变体cwm-f1中观察到了与大白菜突变体cwm类似的矮化和叶片皱缩表型。构建过表达载体35S:Br CWM:GFP,异源转化拟南芥,以T3代转基因植株的c DNA为模板,采用Bra A07g021970.3C的c DNA克隆引物,进行PCR扩增,鉴定到了稳定表达Bra A07g021970.3C的T3代转基因植株。对拟南芥突变体cwm-f1的异位过表达检测发现转基因系Br CWM OX/cwm-f1恢复为野生型拟南芥表型,表明Bra A07g021970.3C是cwm突变体叶片皱缩性状的目标基因。q RT-PCR结果显示,Bra A07g021970.3C在突变体cwm叶片中的表达显著低于在野生型‘FT’叶片中的表达。石蜡切片观察发现,与野生型‘FT’相比,突变体cwm叶肉细胞的维管束更多,叶片更厚,海绵细胞之间和栅栏细胞之间的空隙更大。本研究首次证明皮层微管组织相关蛋白的功能缺失,会造成叶片皱缩。2.克隆了大白菜叶片皱缩突变基因Brlwm,该基因编码H~+-ATPase2。大白菜突变体lwm(leaf wrinkled mutant)叶片皱缩,植株矮小,株型紧凑。遗传分析表明,突变性状是由单隐性核基因控制的。通过Mutmap技术将突变性状相关的候选区域缩小至A01染色体上3.41 Mb区间内,候选区域内有4个非同义SNP分布在4个基因上。KASP验证结果表明突变性状与Bra A01g007510.3C共分离,预测其为突变性状的候选基因。序列分析显示,突变体Bra A01g007510.3C的第4外显子上有一个G到A的非同义SNP突变,导致谷氨酸(Glu)到赖氨酸(Lys)的替换。Bra A01g007510.3C的拟南芥同源基因是AHA2,编码H~+-ATPase2,与植物生长发育密切相关。本团队前期,利用另外一个与lwm表型相近的大白菜叶片皱缩突变体lcm进行基因定位,同样selleck PCI-32765预测到Bra A01g007510.3C是叶片皱缩的候选基因。本研究利用lcm与lwm进行杂交,发现F_1代仍然表现叶片皱缩突变性状,说明lcm和lwm的突变基因是等位的,Bra A01g007510.3C是造成突变表型的基因。q RT-PCR分析结果表明,Bra A01g007510.3C在lwm叶片中的表达显著高于它在野生型‘FT’叶片中的表达。3.精细定位了大白菜叶片皱缩突变基因Brbwm,其编码细胞分裂素氧化酶/脱氢酶CKX。大白菜突变体bwm(blade wrinkled mutant),叶片皱缩,株型紧凑,植株矮小。遗传分析表明,突变性状由单隐性核基因控制;Mutmap基因定位结果表明,突变基因位于A04染色体上的2.11 Mb区间,这个区域内只有1个非同义SNP;KASP验证结果表明突变性状与Bra A04g029320.3C共分离,预测Bra A04g029320.3C为候选基因。Bra A04g029320.3C编码细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CKX),该酶是调节植物生长发育的关键酶。在Bra A04g029320.3C的第1外显子上有一个C-T的突变,导致苏氨酸(Thr)替换为异亮氨酸(Ile)。q RT-PCR结果显示,Bra A04g029320.3C在bwm叶片中的表达显著低于在‘FT’叶片中的表达。