大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)是东亚国家和地区普遍栽培的蔬菜作物,叶片是其光合作用器官和主要的产品器官,叶片宽窄影响叶球形成与发育,叶片皱缩影响光能利用与光合作用,叶片衰老会影响其产品的产量和质量,因此,叶片形态与发育研究历来受到研究者重视。本人所在团队利用0.8%EMS水溶液诱变大白菜双单倍体纯系(DH系)‘FT’的萌动种子,创建了一个包含718份稳定遗传突变材料的突变体库。本研究从中选取窄叶lhd、皱叶lcm和早衰pls等3种叶片发育突变体,在对其突变性状遗传特性分析的基础上,利用Mut Map/BSA-Seq基因定位方法,结合KASP基因分型验证,定位和克隆了突变基因,通过等位变异分析/拟南芥遗传转化实验验证了候选基因的功能。主要研究结果如下:1.克隆了大白菜ANGUSTIFOLIA基因Br AN,利用等位变异验证了其调控大白菜结球的功能利用从结球白菜EMS突变体库中筛选到的窄叶不结球突变体lhd1和lhd2为试材,首先分别与野生型杂交获得F_1,再用两个F_1杂交,证明了两者的突变性状属于等位变异,由单隐性核基因控制。采用Mut Map基因定位方法和KASP基因分型验证,预测Bra A10g000480.3C为候选基因。该基因编码C端结合蛋白ANGUSTIFOLIA,参与细胞在叶宽方向的扩展,将其命名为Br AN。候选基因克隆测序结果表明,突变体lhd1的Br AN第2内含子的第1个碱基发生了由G→A的碱基替换,导致98 bp的第2内含子序列保nonsense-mediated mRNA decay留在CDS序列中,保留序列中含一个TGA终止密码子,造成蛋白质翻译提前终止;突变体lhd2的Br AN第4外显子的第1855个碱基上发生了由G→A的碱基替换,导致形成终止密码子TAG,使蛋白质翻译提前终止。上述两个等位变异的序列分析结果,验证了窄叶不结球性状是由Br AN突变造成的。2.通过拟南芥异源转化实验,验证了Br AN通过调控微管排列影响细胞扩展方向调节大白菜叶片宽度利用Br AN启动子分别与‘FT’中的Br AN和lhd1中Bran构建重组载体,异源转化拟南芥突变体an-t1,证明了大白菜野生型Br AN可以恢复拟南芥突变体的窄叶表型,但突变基因Bran未能恢复。利用激光共聚焦显微镜观察拟南芥的细胞形态和微管排列,发现野生型铺板细胞呈拼图状,细胞内微管随机排列;突变体铺板细胞形状更加规则,宽度较窄,微管排列平行于叶宽方向。Br AN恢复了拟南芥突变体异常的细胞形态和微管排列,而Bran未能恢复。上述结果验证了Br AN通过调控微管排列方式,影响细胞在叶宽方向扩展来调节叶片宽度。3.利用BSA-Seq基因定位方法结合KASP基因分型验证,定位了大白菜皱叶基因Br SCRM皱叶突变体lcm株型矮小,叶片皱缩。遗传分析证明了其突变性状由一对不完全显性核基因控制。利用BSA-Seq基因定位方法,结合KASP基因分型验证,预测Bra A06g038100.3C为候选基因。该基因编码转录因子SCRM,调节气孔发育,将其命名为Br SCRM。克隆测序结果表明,在Br SCRM第1外显子上发生了由G→A的碱基替换,导致所在密码子由精氨酸变成组氨酸。Br SCRM在野生型‘FT’的各个器官中均有表达。亚细胞定位结果表明,Br SCRM位于细胞核中。4.通过拟南芥异源转化实验,验证了Br SCRM突变造成叶片气孔数目激增影响大白菜叶片扩展细胞学观察表明,与野生型相比,叶片皱缩突变体的叶表气孔密度明显增大,突变体与野生型杂交的F_1叶表气孔密度介于两亲本之间。将突变体的Brscrm转入拟南芥野生型中,转基因植株叶表气孔密度显著增大,且叶片皱缩、卷曲,这一结果证明了突变体气孔过度发育影响叶片扩展,与植株叶片皱缩有密切关系。5.克隆了大白菜早衰基因Br SRFR1,通过等位突变体序列变异分析验证了其功能大白菜结球后期,外叶逐渐衰老变黄。但是,早衰突变体pls1和pls2的叶片在结球初期即表现出衰老症状。遗传分析证明了pls1和pls2的早衰性状均由隐性核基因控制。杂交实验证明了突变性状属于等位变异。采用Mut Map基因定位方法和KASP基因分型验证,预测Bra A01g001400.3C为候选基因,该基因编码一个含四肽重复结构域的蛋白SRFR1,参与免疫反应调控,将其命名为Br SRFR1。克隆测序结果表明,突变体pls1的Br SRFR1第7外显子上发生了由C→T的碱基替换,导致形成终止密码子TGA;突变体pls2的Br SRFR1第16外显子上发生了G→A碱基替换,也导致形成终止密码子TGA。6.首次发现了大白菜免疫调节因子Br SRFR1负调控叶片早衰At SRFR1在拟南芥中属于免疫接头蛋白,负调控免疫反应。在RLD生态型的拟南芥中,At SSCH727965 IC50RFR1突变可增强植株对甜菜夜蛾的抗性。本研究抗虫实验结果表明,突变体对甜菜夜蛾的抗性显著高于野生型,验证了其在免疫调节中的负作用。突变体叶片的衰老时期较CP-456773野生型明显提前,叶绿体提早解体,叶绿素含量显著降低。Br SRFR1的表达量随叶片生长发育逐渐增加,在结球晚期达到最高。转录组测序结果表明,多个衰老相关基因在突变体中上调表达,大量光合作用相关基因下调表达,多个茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)信号转导途径中的关键基因在野生型和突变体中差异表达,突变体叶片中茉莉酸和水杨酸含量显著高于野生型,说明突变体的早衰性状可能与茉莉酸和水杨酸合成与信号转导有关。