目的:丙氨酸(alanine,Ala)是一种非必需氨基酸,是许多蛋白质的重要组成部分。研究发现,Ala具有神经保护作用,但是在脑卒中病人血清中Ala含量是降低的,由于Ala极难穿透血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),所以其在脑组织内含量也可能降低并且与神经元的死亡密切相关。因此,本研究旨在设计一种可穿透BBB的纳米载药系统,可以有效地递送Ala至脑组织中,从而发挥神经保护作用。此外,本课题还进一步探究了Ala在缺血性脑损伤中发挥神经保护作用的具体机制。方法:1、大鼠脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤后缺血性小胶质细胞中的Ala水平降低:构建大鼠脑中动脉封闭(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型及细胞氧-糖剥夺(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,通过免疫荧光染色检测缺血性脑损伤后脑组织内Ala含量的变化;通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色检测脑组织梗死体积;使用CCK-8比色法检测神经元存活率。2、Ala-NPs纳米载药系统的制备及其神经保护作用的评估:采用离子交联的方法将带正电荷的壳聚糖(chiAlisertib IC50tosan,CS)与带负电荷的三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate,STPP)制备成单分散的CS纳米粒子(CS-Nanoparticles,CSNPs),将CS、STPP与Ala在水溶液中自组装,合成壳聚糖负载丙氨酸纳米粒子(Ala-NPs)。将Ala-NPs纳米载药系统分别从透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)形貌、DLS粒径和Zeta电位进行表征,并将Ala-NPs纳米载药系统应用到大鼠MCAO模型上进行神经功能缺陷评估。通过免疫荧光标记评估Ala-NPs的BBB通透性;采用TTC染色及改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,m NSS)探讨Ala-NPs纳米载药系统对缺血性脑损伤的神经保护作用。3、Ala抑制小胶质细胞中丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)介导的炎症反应:Western blot检测脑组织及小胶质细胞中PKbiocide susceptibilityM2蛋白表达水平以及免疫荧光观察小胶质细胞激活状态以确定Ala发挥保护作用的分子机制。结果:1、缺血性脑损伤后,脑组织内Ala含量下降,Belumosudil供应商其中小胶质细胞中Ala含量显著下降。脑室注射Ala后可以减少脑组织的梗死体积,而静脉注射Ala无明显的保护作用。使用Ala处理的原代小胶质细胞上清液培养神经元可以减少OGD/R损伤后神经元的死亡率。静脉注射FITC-Ala结果以及免疫荧光结果均证实Ala在缺血性脑损伤中的低BBB通透性。2、纳米颗粒的CS:STTP的浓度比50:1时,TEM图像的结果表明Ala-NPs呈现尺寸均匀、单分散的球形。Ala-NPs的DLS粒径为240-260 nm,Zeta电位为10.7士2.79 m V。这与阳离子纳米颗粒的吸附性内吞作用一致,并允许吸收介导的内吞作用穿透BBB。免疫荧光结果显示,给予MCAO大鼠Ala-NPs干预后,可观察到Ala于小胶质细胞中密集分布。TTC结果显示,注射Ala-NPs可以减少MCAO模型大鼠的脑组织梗死体积;m NSS评分也表明Ala-NPs可以改善MCAO模型大鼠的神经功能损伤。3、Western blot结果表明,缺血损伤发生后,大鼠脑组织和小胶质细胞中PKM2蛋白表达量均显著增加,而Ala干预可逆转这一结局。同时,免疫荧光染色结果显示,Ala可以抑制小胶质细胞激活,减轻炎症反应,而PKM2激动剂TEPP-46可以影响上述神经保护作用结论:本研究从在体实验及离体实验两方面证实了Ala对缺血损伤脑组织的保护作用及靶点。Ala-NPs可将Ala递送至缺血损伤的脑组织内,通过抑制小胶质细胞中PKM2蛋白表达减轻脑I/R损伤从而发挥神经保护作用。这些发现为急性缺血性中风提供了新的治疗策略。