本文旨在研究病毒中重要非结构蛋白行使功能的分子机制,本文共分为两篇研究内容,第一篇为塞内卡病毒3C蛋白酶的结构与功能研究,第二篇为非洲猪瘟病毒异戊二烯合成酶pB318L的结构与功能研究。塞内卡病毒A(SenecaFerrostatin-1体内virus A,SVA)是一种新型的小RNA病毒,感染该病毒可造成猪的水疱病,该病毒的3C蛋白酶在病毒前体蛋白的加工过程以及拮抗宿主抗病毒反应的过程中发挥着关键作用。最近的研究结果表明,在小RNA病毒的3C蛋白酶中参与结合RNA的KFRDI基序具有结合磷脂的双重功能,然而关于3C蛋白酶结合磷脂的分子机制及功能尚未得到深入的研究。在本文的第一篇研究内容中,研究通过X-射线晶体学方法解析了 1.99 A的野生型3C蛋白酶的结构以及1.61 ?的突变体C160A的结构。在解析SVA3C蛋白酶野生型结构的过程中,本研究发现在临近于水解活性位点的区域有一块类似于磷脂分子的未知电子密度。通过磷脂结合实验和脂质组学手段,本研究鉴定出了SVA 3C结合的磷脂种类主要为心磷脂(Cardiolipin,CL),并确定了上述结构中未知电子密度代表的心磷脂组分为CL 74:6。结合3C蛋白酶结合磷脂的结构信息,本研究通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)鉴定出了 3C蛋白酶参与结合心磷脂的关键氨基酸残基为His75以及His78。此外,本研究还发现了 SVA 3C能够通过结合心磷脂定位于线粒体内膜。更为重要的是,研究表明了磷脂的结合不仅能够影响3C的蛋白酶活性,而且对病毒的复制也具有影响。基于上述研究,为小RNA病毒3C蛋白酶结合磷脂的研究提供了结构生物学方面的支持。非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是一种烈性致病的病原体,该病毒能够在家猪和野猪中造成极高的感染率和致死率。ASFV编码了一种特殊的异戊二烯合成酶pB318L,该蛋白是病毒复制过程中的必需蛋白,然而关于pB318L在病毒生命周期中行使功能的详细机制尚不明确。在本文的第二篇研究内容中,研究通过X-射线晶体学方法解析了 3.20 A的pB318L晶体结构。在解析结构的过程中,在使用多个已知结构的同源蛋白作为模版都无法解析出相位的情况下,本研究尝试利用AlphaFold2预测模型作为分子置换的模板,最终顺利解析出了结构。基于pB318L的晶体结构,本研究对AlphaFold2预测蛋白NSC 119875化学结构结构的准确性尤其是针对氨Oral microbiome基酸侧链的预测准确性进行了深入分析,表明AlphaFold2预测模型中的非极性残基的预测准确性优于极性残基的预测准确性。同时,本研究结合AlphaFold2预测模型与小角散射实验,提出了 pB318L在溶液中形成的同源二聚体的构象特征。此外,为了阐明pB318L在病毒复制过程中发挥的功能,本研究采用细胞生物学及免疫学的手段研究了 pB318L在真核细胞中的亚细胞定位,并发现pB318L能够进入细胞核。提示pB318L可能参与免疫逃逸。随后,本研究初步探索了 pB318L抑制JAK-STAT信号通路的机制,提出了 pB318L负调控I型干扰素信号通路的可能作用机制,为认识pB318L在病毒复制过程中发挥的作用提供了研究基础。