研究背景和目的:发病人数约占原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)患者总数15%的肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是PLC中第二常见的肝脏恶性肿瘤,其肿瘤可位于肝内左右叶各级胆管(二级及以上)。ICC发病隐匿,且发生时常伴有转移潜能的获得,因此初诊时即失去根治性切除术机会的ICC患者占了相当大的比例,即便切除,此类患者也因为ICC的高侵袭性、高化疗耐药性和早期转移immunoregulatory factor的特性而预后不佳,总体5年生存率为23.6%。近年来,尽管得益于基因组学、转录组学、selleck合成蛋白质组学等测序技术的发展,人们对ICC的发生发展有了一定程度的认知,但在全球范围内,ICC的发病率和死亡率仍呈现上升趋势。虽然针对ICC多个靶点(如:FGFR2融合或重排、IDH1突变、NTRK融合变异、BRAFV600E)的靶向药物(如:培米替尼和英菲格拉替尼)相继上市,但由于其受众面较窄,大部分ICC患者仍然无法从中受益。因此,从多角度全面而持续的理解ICC发生发展及转移相关的机制对于ICC的临床治疗具有重要意义。近年来,人们已经逐渐意识到,恶性肿瘤的发生发展不仅取决于各种因素导致的体细胞突变,肿瘤细胞自身所处的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)在肿瘤的发生发展过程中也发挥了关键作用。然而囿于之前技术上的局限,人们始终无法通过一次检测就精准获得TME中所有细胞的信息。单细胞测序技术自2013年被Nature Methods评为年度技术以来,目前,已有少数几项研究利用该技术对ICC患者肿瘤组织免疫微环境的异质性进行了评估,然而目前缺乏对早晚期ICC患者原发灶(primary tumor,PT)、癌旁组织(tumor-adjacent tissue,TAT)、肝内转移灶(intrahepatic metastasis,IHM)和淋巴结转移灶(metastatic lymph node,MLN)中肿瘤免疫微环境异质性的系统性研究。本研究拟在单细胞转录组水平系统性阐明早晚期ICC患者PT及TAT中肿瘤及其免疫微环境的异同,尤其是晚期ICC患者PT、IHM、MLN和TAT中肿瘤及其衍生的免疫微环境的组成及功能,同时针对ICC患者IHM或MLN与PT中所存在的不同或相同的肿瘤细胞及免疫细胞类型,寻找具有临床意义的肿瘤靶点或免疫细胞,为ICC患者的药物研发及临床治疗决策提供新的观点和思路。研究方法:1.依据美国癌症联合委员会第八版ICC指南标准并基于10x Genomics单细胞测序平台,共纳入4例ⅠA期、3例ⅢB期ICC患者的19个肿瘤及相关组织(包括7个PT、7个对应的TAT、3个对应的IHM以及2个对应的MLN)的单细胞转录组数据,其中3例ⅢB期ICC患者的11个样本数据由本研究收集并测序获得,4例ⅠA期ICC患者的8个样本数据下载自人类遗传资源组学原始数据归档库(HRA000863)。2.基于Meta Cell、sc VI、sc DC等算法,对不同疾病阶段ICC患者不同组织部位中髓系来源的中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴系来源的T细胞、NKs的特异性分布、浸润情况及功能差异进行全局和局部分析,并结合相关临床研究队列使用ss GSEA算法及单因素和多因素Cox回归分析筛选具有治疗意义的免疫细胞亚群。3.利用Cell Phone DB算法寻找具有相互作用关系的免疫细胞亚群,并利用多色免疫荧光验证ICC患者PT和IHM中存在的CD8~+CXCL13~+TIM3~+T细胞、CD56~+CD49a~+TIM3~+lr NKs和CD68~+CSF1R~+LGALS9~+TAMs亚群及其可能存在的相互作用。4.利用肿瘤细胞干性评分、上皮间质转化评分、基因集富集分析并结合相关临床队列的单因素和多因素Cox回归分析探索ICC患者肿瘤细胞中存在的转移优势亚群。进一步使用转录因子分析确定转移优势亚群的关键调控因子,随后通过临床队列验证其临床意义。5.利用过表达慢病毒在ICC细胞系HUCCT1、RBE、HCCC9810中构建SPDEF过表达细胞系,并利用干扰慢病毒在ICC细胞系HUCCT1、RBE中构建SPDEF敲低细胞系,随后通过一系列体外实验研究SPDEF过表达和干扰对于ICC细胞增殖、凋亡、迁移的影响。6.利用CUT&Tag和Bulk转录组测序技术对过表达SPDEF的HUCCT1细胞系进行测序,进一步研究SPDEF对于相关信号通路改变的影响。研究结果:1.处于不同疾病阶段的ICC患者TAT和PT中免疫细胞比例存在显著改变,而处于相同疾病阶段的ICC患者不同组织部位中的免疫细胞浸润程度也有所不同。2.晚期ICC患者肿瘤组织中存在一群CCL18~+MRC1~-TAMs,该亚群在ICC抑制性TME的重塑及肿瘤进展过程中发挥了重要作用。3.Neu-EGR1是早期ICC患者PT中主要存在的中性粒细胞亚群,与ICC患者良好的临床预后有关,而Neu-VEGFA和Neu-IL1B则富集在晚期ICC患者PT和IHM中,与其较差的临床预后有关。4.CD8-CXCL13 T是ICC肿瘤特异性T细胞,其处于分化早期的亚型IFNG-CXCL13 T细胞高浸润有利于ICC患者的生存,而处于分化晚期的亚型CXCR4-CXCL13 T细胞高浸润则与ICC患者不良临床预后相关。另外,处于分化晚期的亚型MKI67-CXCL13 T细胞具有较高的细胞毒性,与ICC患者较好的预后相关。5.晚期ICC患者PT和IHM中存在CD8~+CXCL13~+VX-445研究购买TIM3~+T细胞、CD56~+CD49a~+TIM3~+lr NKs和CD68~+CSF1R~+LGALS9~+TAMs,三者在空间位置上可能通过CSF1R/CSF1和LGALS9/TIM3轴进行细胞间相互作用,进而诱导TAMs向M2样巨噬细胞转化,并同时抑制T细胞和NKs的抗肿瘤功能。6.ICC患者肿瘤细胞中存在具有转移优势的亚群,并且其高表达的转录因子SPDEF能够显著促进肿瘤细胞增殖,减少肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞的转移定植,是ICC患者临床预后的独立危险因素。研究结论:本研究在单细胞转录组水平阐明了早晚期ICC患者肿瘤及癌旁等组织中肿瘤及其免疫微环境的组成异同,尤其是晚期ICC患者PT、IHM、MLN和TAT中肿瘤及其衍生的免疫微环境的组成及功能,发现处于疾病不同阶段相同部位或相同阶段不同部位中的免疫细胞浸润存在显著差异。另外,本研究详细比较了巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞、NKs的时空(疾病阶段及组织部位)特异性分布及可能存在的相互作用,发现无论是固有免疫还是适应性免疫细胞,其中均存在促进或抑制肿瘤进展的细胞亚群。最后,通过对ICC肿瘤细胞中存在的转移优势亚群进行分子生物学水平的探索,本研究发现其表达的转录因子SPDEF能够显著促进ICC肿瘤细胞增殖及转移定植的能力,并与ICC患者的不良预后相关,可以作为ICC患者临床预后的独立危险因素。总之,本研究为ICC患者的药物研发及今后临床治疗决策的优化提供了一定的思路和理论依据。