作为临床常见危重症之一,急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是指多种病因引起的短时间内肾功能快速减退而出现的临床综合征。尽管AKI的发生率和死亡率较高,但目前临床的主要治疗方式为对症支持疗法,包括纠正电解质紊乱、维持酸碱平衡和提供营养支持等措施,尚无更积极有效的针对性治疗方法。由于AKI病因的复杂性和肾脏的特殊结构,其靶向药物递送系统一直是研究难点,亟需开发更有效的药物、设计更具针对性的靶向递送系统来预防和治疗AKI。AKI的损伤机制通常包括氧化应激、炎症、细胞凋亡、细胞膜损伤、细胞内酸碱平衡失调等。因此,通过降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、抑制炎症、减少细胞凋亡等机制有可能改善AKI。为筛选治疗AKI的化合物,通过检索PUBMED、SciFinder等文摘数据库,知网、万方等全文数据库,Web of Science、Chinese Science Citation Database 等引文数据库,以及药渡、药易云等新药研发数据库,建立了包含341种化合物的AKI候选化合物库。经过细胞毒性模型、细胞损伤模型、细胞炎症模型,以及大鼠AKI模型的筛选,发现小分子化合物磷酸芦可替尼(ruxolitinib phosphate,RP)可以通过炎症抑制作用和细胞保护作用来改善AKI,具有良好的治疗肾脏疾病的潜力。但芦可替尼具有一定的血液学毒性,可能导致循环中的白细胞、淋巴细胞、血小板、中性粒细胞水平降低,在一定程度上限制了其临床应用。因此,本课题设想通过制剂学手段提高芦可替尼的肾脏靶向性,降低其对非靶组织的毒副作用,增强芦可替尼对AKI的治疗效果。近年来,新型二维材料黑磷纳米片(black phosphorus nanosheets,BPNSs)在生物医学领域得到了广泛的关注和应用。BPNSs在肾脏靶向递送领域具有以下优势:首先,其较高的表面积与体积比利于提高载药量;其次,它的片层结构可以形状依赖性的被动靶向肾脏;除此之外,BPNSs在较低的pH环境下可以加速释放药物,AKI中患病肾脏在炎症情况下存在酸性微环境,BPNSs载药的pH响应性释放有利于肾脏给药;最后,BPNSs可以快速清除病变部位过度累积的ROS,有效保护肾脏。因此,本课题选用BPNSs作为药物递送载体,高效装载芦可替尼进行肾脏靶向给药。肾小管损伤是AKI的主要表现之一,因此肾小管上皮细胞是AKI治疗的重要靶点。带正电的肾小管靶向肽G3-C12能够通过巨蛋白介导的内吞作用在近端小管被重吸收,有效提高偶联药物在肾脏中的累积。为提高BPNSs的靶向性,使用G3-C12肽通过静电相互作用进行修饰,构建了 RP@BPNSs@G3-C12功能化纳米递药系统。该系统通过静脉注射进入血液循环,主动靶向至肾小管上皮细胞,被肾小管上皮细胞内吞后释放芦可替尼,缓解肾脏损伤。本课题使用液相剥离法制备BPNSs,通过静电相互作用制备RP@BPNSs@G3-C12;设计正交试验对制备方法进行优化,考察芦可替尼与BPNSs的质量比、AMG510分子量搅拌时间、离心转速和离心时间对RP@BPNSs@G3-C12的包封率的影响,以确定最佳制备条件;然后对优化后的制备方法进行验证,发现RP@BPNSs@G3-C12的包封率为87.4%,表明该制备方法具有良好的稳定性和可行性。接下来对纳米递送系统进行了理化性质表征。DLS结果表明,非靶向BPNSs的粒径为 106.0 nm,Zeta 电位为-29.6±6.81 mV;靶向 BPNSs@G3-C12 的粒径为 122.4 nm,Zeta电位为-13.3±4.59 mV;RP@BPNSs@G3-C12的粒径为132.8 nm,Zeta电位为-5.31±4.83 mV,Zeta电位的改变提示芦可替尼和G3-C12通过静电相互作用成功吸附在BPNSs表面;透射电子显微镜观察到BPNSs具有片层结构;体外释放结果表明,与pH=7.4的情况下相比,芦可替尼的释放速率在pH=5.0时大大增加,说明递送载体在酸性环境中快速释放药物,有利于对疾病状态下的肾脏给药;稳定性评价结果显示,递送载体在储存和体内循环中均具有较好的稳定性;同时,本课题研究了递送系统的细胞毒性和细胞摄取机制,发现在0～200μg/mL的浓度范围内,BPNSs及其制剂没有明显的细胞毒性;并且,研究发现G3-C12修饰后递送系统的细胞摄取增加,其内吞过程主要是通过能量依赖的巨胞饮作用介导的。采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的NRK-52E细胞模型评价了RP@BPNSs@G3-C12的体外抗炎作用。NRK-52E细胞与递送系统共孵育后,发现LPS诱导的细胞上清液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素6(interleukin6,IL-6)的含量降低;LPS诱导的细胞中TNF-α、IL-6的mRNA水平和JNK、NF-κB蛋白的磷酸化水平均下降,说明递送载体可有效抑制LPS诱导的NRK-52E细胞炎症。采用阿霉素和过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)诱导的NRK-52E细胞损伤模型评价了 RP@BPNSs@G3-C12的细胞保护作用。发现递送载体以浓度依赖的方式保护细胞免受阿霉素诱导的细胞死亡,并抑制H2O2诱导的细胞氧化应激,降低ROS水平;在体外抗细胞凋亡作用研究中,发现递送载体抑制了 H2O2诱导的细胞凋亡,递送载体预处理后,细胞内cleaved Caspase-3的蛋白水平和Caspase-3的活性均显著降低,表明递送载体对阿霉素诱导的细胞损伤、H202诱导的体外氧化应激和细胞凋亡具有良好的保护作用。采用阿霉素诱导的AKI大鼠模型评价了 RP@BPNSs@G3-C12的体内药效学,并进行了作用机制研究。首先对递送载体的生物相容性进行了评价,发现其具有良好的生物安全性,对芦可替尼的血液学毒性具有较好的改善作用,并且其在尾静脉注射后可以快速靶向并特异性地积聚在AKI大鼠的肾脏中;接下来检测了大鼠的肾功能指标,并对肾脏进行H&E染色、TUNEL染色、CD68免疫染色,发现递送载体给药后AKI大鼠的肾功能明显改善;提取大鼠肾脏mRNA并进行RNA-Seq研究递送载体的作用机制,发现其治疗作用是通过细胞凋亡、炎症、氧化磷酸化等通路介导的;进一步对相关通路进行验证,发现递送载体给药后,大鼠血中TNF-α、IL-6及白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)的水平下降,提示全身炎症状态的改善;AKI大鼠的肾损伤分子1(serum kidney injRegorafenib体外ury molecule-1,KIM-1)、中性粒细胞相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)genetics polymorphisms的水平,以及 Caspase-3 的活性降低,提示其对肾脏损伤的修复作用;最后,检测了大鼠肾脏中ROS、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量变化,发现递送载体可以显著提高肾脏的SOD活性,降低ROS活性及MDA含量,说明递送载体给药抑制了大鼠肾脏的氧化应激状态。综上,本课题发现了芦可替尼作为AKI治疗药物的巨大潜力,并构建了RP@BPNSs@G3-C12药物递送系统,具备良好的AKI肾脏靶向能力和pH响应性释药特性。体内外研究均显示出RP@BPNSs@G3-C12对炎症、氧化应激和细胞凋亡的显著抑制作用,并对阿霉素诱导的AKI损伤具有明显的治疗效果,表明RP@BPNSs@G3-C12作为一种新型肾脏给药递送系统,在AKI治疗方面具有巨大的优势和潜在的临床应用价值。