日本脑炎病毒(JEV)以蚊子为主要媒介,以猪为宿主,全球约有60%人口生活在乙脑病毒覆盖的范围。每年有5万至17万人类乙脑病例报告,致死率可高达30%,约50%患者出现长期神经系统后遗症;对于猪来说,怀孕母猪感染JEV可导致流产、死胎等,受感染的小猪可能表现出致命的神经系统疾病。JEV对人类和动物健康构成重大风险。JEV导致的流行性日本脑炎曾在24个国家引起了广泛的传播,包括澳大利亚、日本、印度以及西太平洋和东南亚的大部分地区。基于Envelope蛋白核苷酸序列可将JEV分为五种基因型,即基因型I–基因型V。在我国基因III型毒株最先被检测到,自1977年在云南分离以来,基因Ⅰ型JEV与基因Ⅲ型JEV共存,其他基因型偶有报道。掌握目前我国JEV毒株分布与流行情况对于后续JEV的机制研究及防控具有重要意义。JEV能够穿过血脑屏障,对中枢神经系统(CNS)造成损害。CNS薄壁组织中的小胶质细胞是巨噬细胞的一种,是抵御入侵病原体的第一道防线。病原体入侵时,小胶质细胞被迅速激活,释放炎症细胞因子以介导炎症反应。小胶质细胞的大量激活是脑内JEV感染的标志性特征之一。巨噬细胞谱系的募集是防止病毒造成损伤的关键组成部分,对病毒的先天免疫反应可能会增强病毒引起的炎症反应并导致CNS的损伤。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)能够识别病原体相关分子模式(PAMP),从而诱导刺激免疫和宿主防御的活动,这一家族蛋白质是免疫激活的最早决定因素之一。登革病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒等均可以被TLR识别并引起先天免疫的激活。先前的研究认为TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9是识别JEV的关键受体蛋白,虽然TLR2的敲除也被发现延长小鼠的生存时间,但对于TLR2在JEV引起的炎症反应中作用并不清楚。本研究针对TLR2介导JEV引起炎症反应的信号通路,通过JEV分子流行病学调查确定国内目前流行的毒株,以小胶质细胞、巨噬细胞和小鼠为研究对象,探究TLR2在JEV感染中介导炎症反应的作用。主要开展了以下研究:JEV分子流行病学监测扩增到13条JEV E基因序列,并表明优势流行毒株为基因I型;预测到74个磷酸化位点及其激酶,其中9个位点发生突变。为确定我国JEV的分子流行情况和我国目前流行的JEV毒株基因型,对中国11省的3105只哺乳动物(猪、狐狸、貉、牦牛和山羊)和17300只蚊子进行了JEV分子流行病学调查。在黑龙江(12/328,3.66%)、吉林(17/642,2.65%)、山东(14/832,1.68%)、广西(8/278,2.88%)和内蒙古(9/952,0.94%)的猪、西藏的山羊(1/51,1.96%)和云南的蚊子(6/131,4.58%)中检测到JEV。在黑龙江(5/13)、吉林(2/13)和广西(6/13)的猪中扩增了13个JEV囊膜(E)基因序列进行系统发育分析,并对E蛋白′N154的糖基化位点和磷酸化位点进行预测。成功建立了JEV感染小胶质细胞6hpi、12hpi、24hpi的差异蛋白表达谱和磷酸化修饰谱,明确了JEV通过TLR2-PI3K-AKT通路激活小胶质细胞炎症反应。为全面揭示JEV感染小胶质细胞的蛋白表达变化情况,使用蛋白质组学和磷酸化修饰组学评估JEV感染小胶质细胞引起的广泛反应,并比较感染6小时、12小时和24小时(hpi)的差异蛋白表达和磷酸化修饰,确定了TLR2在JEV感染小胶质细胞的炎症反应中的作用。在6hpi时检测到212种上调蛋白,在12h时检测到754种,在24h时检测到191种。根据GO和KEGG富集分析,上调蛋白显示与免疫应答相关的蛋白富集。平行反应监测试验(PRM)、Western Blot和q PCR结果表明,TLR2、PI3K、AKT的表达水平增加,PI3K、AKT磷酸化水平上升。接头蛋白My D88未被激活,My D88下游的关键蛋白如IRAK1、IRAK4和TRAF6的表达水平没有增加;证实JEV激活TLR2-PI3K-AKT通路,从而导致了强烈的炎症反应。成功建立了JEV感染巨噬细胞6hpi、12hpi、24hpi的差异蛋白表达谱malignant disease and immunosuppression和磷酸化修饰谱,JEV通过TLR2-PI3K-AKT通路激活巨噬细胞细胞炎症反应,并通过TLR2调控巨噬细胞的焦亡。通过蛋白组学和磷酸化修饰组学对巨噬细胞感染6小时,12小和24小时进行了全方位展示。JEV感染selleck NMR6小时细胞因子介导的信号通路、TNF信号通路相关蛋白被激活,感染后12小时固有免疫应答、凋亡信号通路、TLR相关通路被激活;感染后24小时的防御反应、酶抑制剂活性相关信号通路激活。同时比较了巨噬细胞和小胶质细胞面对JEV感染的信号通路激活差异。确定了JEV感染巨噬细胞后通过TLR2-PI3K-AKT通路诱导强烈的炎症反应。组学数据中发现感染后12小时有关细胞程序性死亡通路被激活,而焦亡和凋亡均与炎症反应有关。通过Western blot检测发现NLRP3、cas1及GSDMD均被激活,证明了TLR2调控NLRP3的表达,NLRP3调控焦亡关键蛋白Cas1和GSDMD。而凋亡相关蛋白Bax、cyc、cas9、cas3等未发现明显激活,表www.selleck.cn/products/empagliflozin-bi10773明TLR2调控JEV引起的巨噬细胞焦亡。JEV通过TLR2介导小鼠原代巨噬细胞及脑、睾丸中的炎症反应,且TLR2调控PI3K、AKT的表达;TLR2激活会缩短小鼠感染JEV的生存时间。体外研究表明TLR2-PI3K-AKT通路是炎症反应的关键通路,而NF-κB通路、My D88通路并未参与该通路。为了进一步探究TLR2蛋白在JEV引起小鼠炎症反应中的作用,JEV分别感染野生型(WT)小鼠及TLR2缺失(TLR2~(-/-))小鼠,确定了TLR2在小鼠体内介导炎症反应的作用。检测了WT小鼠及TLR2~(-/-)小鼠原代巨噬细胞、脑、血液、睾丸中的炎症因子表达,TLR2~(-/-)小鼠均表现更弱的炎症反应。PI3K和AKT受TLR2调控,与第二章和第三章的研究结果一致。监测了JEV感染WT小鼠和TLR2~(-/-)小鼠的生存情况,WT小鼠的生存时间短于TLR2~(-/-)小鼠,表明TLR2激活缩短JEV感染小鼠生存。综上所述,本研究对中国11省5种哺乳动物和蚊进行了JEV分子流行病学调查,并确定了我国东北部省份及云南、广西流行的JEV为基因I型。建立了JEV感染小胶质细胞6hpi、12hpi、24hpi的差异蛋白表达谱和磷酸化修饰谱和巨噬细胞6hpi、12hpi、24hpi差异蛋白表达谱和磷酸化修饰谱;JEV通过TLR2-PI3K-AKT通路引起小胶质细胞和巨噬细胞细胞炎症反应,并通过TLR2调控巨噬细胞焦亡。TLR2是原代巨噬细胞及小鼠脑、睾丸、血液中介导炎症反应的关键蛋白,并调控PI3K和AKT的表达;TLR2激活缩短了感染JEV小鼠的生存时间。以上研究结果阐述了JEV引起的炎症反应机制,完善了TLR2及相关通路的作用,为今后JE的防控及治疗奠定了重要的基础。