肥胖相关的胰岛素抵抗已经成为我国40岁以上2型糖尿病患病的主要病因,但在18-40岁发病的成人早发2型糖尿病(Early-onset type 2 diabetes mellitus,EOD)中,肥胖相关胰岛素抵抗所起的作用及发生机制尚不清楚。研究发现,脂肪组织炎症是导致肥胖相关胰岛素抵抗的重要机制,自噬作为维持机体内部稳态的机制,在调节炎症中发挥关键作用。因此,研究年轻(18≤年龄≤40岁)肥胖患者脂肪组织炎症是如何被自噬调节并导致胰Trichostatin A核磁岛素抵抗,将为防治胰岛素抵抗及EOD提供重要理论依据。【目的】本课题从分析初诊断成人EOD患者胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能入手,明确二者作为EOD患病影响因素的相对重要性及肥胖对二者的影响。通过体外实验明确自噬溶酶体途径在脂肪细胞炎症中的作用。最后通过病例对照研究,分析年轻(18≤年龄≤40岁)肥胖患者大网膜脂肪组织炎症与胰岛素抵抗的相关性,验证自噬溶酶体途径在年轻肥胖患者大网膜脂肪组织炎症中的作用及机制,期望为预防和治疗年轻肥胖患者胰岛素抵抗和EOD提供新的思路及靶点。【方法】1.采用病例对照研究,收集2019年1月至2021年2月在某三甲医院住院的初诊断成人EOD患者179例,收集同期经OGTT筛查排除糖尿病者179例为对照组,收集性别、年龄、身高、体重、胰岛素、血脂等资料,计算体重指数(Body mass index,BMI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素分泌指数(HOMA-β),并进行统计学分析,明确胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能障碍对EOD患病的重要性以及与肥胖的相关性。2.采用不同浓度梯度(0、0.25、0.5、1m M)棕榈酸干预成熟3T3-L1脂肪细胞。通过蛋白质印迹法(western blot,WB)结合RFP-m Wasabi-LC3b腺病毒转染和共聚焦显微镜检测脂肪细胞的自噬流改变。q RT-PCRtranscutaneous immunization及WB检测组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)、组织蛋白酶L(Cathepsin L,CTSL)的表达。试剂盒检测脂肪细胞CTSB酶活性、CTSL酶活性、氧化应激指标活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平及抗氧化指标超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性。WB检测脂肪细胞自噬调节蛋白转录因子EB(Transcription factor EB,TFEB)、溶酶体膜关联蛋白2(lysosome associated membrane protein 2,LAMP2)及自噬起始蛋白Beclin1表达。q RT-PCR检测脂肪细胞炎性因子趋化因子配体2(C-C motif chemokine 2,CCL2)、白介素6(IL-6)和白介素1β(IL-1β)的表达,WB检测IL-6和Caspase 1表达。比较不同浓度棕榈酸干预下脂肪细胞各检测指标与对照组(棕榈酸0m M)的差异。探讨自噬溶酶体途径在棕榈酸诱导的脂肪细胞炎性因子表达中的作用。3.采用病例对照研究,51例肥胖患者及12例非肥胖患者,均为40岁以下年轻成人(18岁≤年龄≤40岁),收集临床数据,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。收集所有患者大网膜脂肪组织,提取RNA,q RT-PCR检测CTSB、CTSL和炎性因子(CCL2、IL-6和IL-1β)在m RNA水平表达。比较两组脂肪组织炎性因子表达,分析炎性因子与患者HOMA-IR的相关性。比较两组脂肪组织CTSB及CTSL表达,并分析CTSB和CTSL对炎性因子表达的影响。收集的肥胖和非肥胖病例按年龄和性别进行匹配,得到年龄和性别一致的年轻(18岁≤年龄≤40岁)患者,取大网膜脂肪组织,WB检测自噬指标(P62、LC3-II)、组织蛋白酶(CTSB和CTSL)及炎性指标(CCL2、IL-6和Caspase1)蛋白表达,分析年轻肥胖患者大网膜脂肪组织自噬流、CTSB、CTSL及炎性因子表达改变。验证自噬溶酶体途径在年轻肥胖患者大网膜脂肪组织炎症中的作用。【结果】1.EOD组和对照组间性别和年龄没有差异。EOD组中体重指数(BMI)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、胆固醇(Total Cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(Low-Density Lipoproteins,LDL)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)均高于对照组(P<0.05),高密度脂蛋白(High-Density Lipoproteins,HDL)及胰岛素分泌指数(HOMA-β)低于对照组(P<0.05)。将HOMA-IR及HOMA-β取自然对数,并标准化为Z值后进行logistic回归分析,结果显示HOMA-IR是EOD的危险因素(OR=3.166,P<0.001),HOMA-β是EOD的保护性因素(OR=0.012,P<0.001),HOMA-IR对EOD患病的影响高于HOMA-β。对HOMA-IR进行多元线性回归分析,显示BMI是HOMA-IR的影响因素,方程为Ln(HOMA-IR)=0.299×BMI(R~2=0.144,P<0.05),提示胰岛素抵抗对成人EOD患病影响高于胰岛β细胞功能障碍,肥胖是胰岛素抵抗的危险因素。2.高浓度棕榈酸(0.5,1m M)干预脂肪细胞上调LC3-II及P62表CH-223191纯度达,P62转换分析提示P62降解受阻。RFP-m Wasabi-LC3腺病毒转染脂肪细胞也显示自噬清除受阻。高浓度棕榈酸(0.5,1m M)干预脂肪细胞CTSB和CTSL m RNA表达均上调(P<0.05),活性CTSL蛋白(25kd)表达及CTSL酶活性下降(P<0.05),活性CTSB蛋白(35kd)及CTSB酶活性上调(P<0.05),ROS水平增加,SOD活性下降(P<0.05)。棕榈酸(0.25,0.5,1m M)上调细胞核内TFEB蛋白表达(P<0.05),LAMP2,Beclin1蛋白表达未见差异。棕榈酸(0.5,1m M)干预脂肪细胞增加炎性因子CCL2及IL-6 m RNA表达,上调IL-6蛋白及激活IL-1β的上游蛋白Caspase1(10kd)表达。结果提示棕榈酸干预下脂肪细胞存在自噬溶清除障碍,且与LAMP2及Beclin1无关,CTSL成熟障碍及酶活性下降是导致自噬溶酶体清除障碍的主要原因,同时CTSB蛋白表达及酶活性增加,共同促进脂肪细胞炎性因子表达。3.与非肥胖组相比,肥胖组患者大网膜脂肪组织CCL2、IL-6和IL-1βm RNA表达均上调,并与HOMA-IR呈正相关(r=0.353-0.457,P<0.01)。CTSB和CTSL m RNA表达均上调(t=2.693,P<0.01;t=2.849,P<0.01),二者间呈强正相关(r=0.836,P<0.001),二者均与TC相关(std.β=0.443,P<0.05;std.β=0.439,P<0.05),仅CTSB m RNA水平与BMI相关(std.β=0.261,P<0.05)。多元回归分析提示,CTSL与CCL2、IL-6和IL-1β独立相关(std.β=0.352-0.462,P<0.05)。结果提示大网膜脂肪组织炎症与胰岛素抵抗呈正相关,年轻肥胖患者大网膜脂肪组织CTSB及CTSL m RNA水平均上调且存在相互调节关系,CTSL是大网膜脂肪组织炎性因子表达的独立影响因素。年轻肥胖患者与非肥胖患者相比,WB检测大网膜脂肪组织中炎性指标(CCL2、IL-6和Caspase 1)均上调(P<0.05);活性CTSB蛋白表达上调,活性CTSL蛋白表达下调(P<0.05),自噬指标LC3II及P62均增加(P<0.05),提示年轻肥胖患者脂肪组织内存在自噬溶酶体途径障碍及炎性因子蛋白表达上调。【结论】1.肥胖相关的胰岛素抵抗对成人早发2型糖尿病患病影响高于胰岛β细胞功能障碍。2.棕榈酸干预下脂肪细胞CTSL成熟障碍,CTSL酶活性下降,导致自噬溶酶体清除受阻,CTSB表达及酶活性代偿性增加,共同增加脂肪细胞炎性因子表达。3.年轻肥胖患者大网膜脂肪组织炎性因子表达上调并与胰岛素抵抗指标(HOMA-IR)呈正相关,脂肪组织炎症可能在年轻肥胖患者胰岛素抵抗中发挥重要作用。4.大网膜脂肪组织CTSL的表达是年轻肥胖患者大网膜脂肪组织炎症的独立影响因素。与CTSL及CTSB相关的自噬溶酶体途径障碍在年轻肥胖患者脂肪组织炎症中发挥作用。