N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu Ac)是一种带负电荷的功能性单糖,广泛存在于多种植物、动物和微生物中。Neu Ac具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗粘连活性,在制药领域具有应用的潜力,同时Neu Ac也是乳制品中重要的添加剂,可以增强婴儿的免疫力、促进大脑和骨骼的发育。发酵法和天然提取法生产Neu Ac存在产物回收率低、副产物较多、易造成环境污染等劣势,阻碍了其工业化应用。此外,目前在酶法合成Neu Ac的研究中主要采用纯化后的酶,增加了生产成本,不利于工业生产。本研究对Neu Ac醛缩酶(N-acetylneuraminic acid aldolase,Nan A)进行热稳定性改造并开发了一种基于粗酶固定化的无细胞体系(crude enzyme immobilization-based cell-free system,CEICFS)用于Neu Ac的合成。本论文主要研究内容如下:(1)重组酶在大肠杆菌中的异源表达。首先克隆鱼腥藻(Anabaena sp.CH1)来源的编码N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(N-acetylglucosamine-2-epimerase,AGE)的基因bage和葡萄球菌(Staphylococcus.hominis EFS20452.1)来源编码Neu Ac醛缩酶的基因nan A至表达载体p ET28a,在大肠杆菌中进行异源表达。进一步优化了重组酶的表达条件,将异源表达得到的粗酶液用于酶法合成Neu Ac,以0.4 mol·L~(-1) Glc NAc和1.0mol·L~(-1)丙酮酸钠为底物,反应10 h得到43.6 g·L~(-1) Neu Ac,其中Glc NAc的摩尔转化率为35.3%。(2)为了提高关键酶AGE和Nan A的表达水平,比较了融合促溶标签、伴侣蛋白和优化N-端编码序列(N-terminal coding sequence,NCS)三种策略对蛋白表达量的影响。结果发现融合促溶标签虽然可以提高重组酶的表达量,但导致酶活性降低;分子伴侣质粒对重组酶表达量的提高没有明显的效果,优化NCS使关键酶的表达量得到明显的提高。以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为报告蛋白,构建长度为30 nt的NCS突变文库并从中筛选出较优的突变体。通过优化NCS,AGE的表达量提高了1.5倍,达到14.82 U·m L~(-1),同时Nan A酶的表达量提高了1.2倍,达到12.65 U·m L~-1。(3)为了提高AGE和NBMS-907351an A的热稳定性,以酶的蛋白质序列和结构为出发点,对AZD6738核磁酶进行半理性改造。对biomarkers tumor两种方法筛选的位点进行定点突变,发现AGE的热稳定没有明显提高。相比于Nan A,突变体Nan A_(S188C/A197C)在50℃条件下的活性保留提高了3.9倍,在65℃的条件下半衰期由48.5 min提高至95.3 min,比活力提高了1.25倍。V_(max)为5.20μmol·min~(-1)·mg~(-1),K_m为93.88 mg·m L~(-1),k_(cat)为16.52 min~(-1),催化效率提高了142%。结构分析及分子动力学模拟表明,酶结构刚性的增加有效提高了Nan A突变体的热稳定性。(4)无细胞体系的固定化研究。根据固定化的方法对载体进行筛选,确定最佳固定化载体为氨基树脂LXTE-703。随后优化了固定化酶的条件,确定最优固定化条件:25 m L AGE(Nan A)粗酶液中加入5 g LXTE-703树脂置于25(30)℃,170 rpm的摇床中固定化12 h。考察固定化酶的酶学性质发现:最适反应温度和p H均和游离酶一致,温度稳定性高于游离酶,p H适应性较游离酶更宽泛。固定化酶的K_m增加,表明酶对底物的亲和力下降。CEICFS合成Neu Ac的产量达到了68 g·L~(-1),重复使用5次后仍可保留78%左右的酶活。