结直肠癌(Colorectal cancer,CRC),又名大肠癌,是一种发生在结肠直肠上皮的恶性肿瘤,2020年WHO统计数据表明,在全球范围内,CRC发病率位列第三,死亡率位列第二。2020年全球结直肠癌新发病例数约193万,死亡病例数约93万,中国结直肠癌新发病例达55万,死亡病例约28万。中国是全球结直肠癌疾病负担较为沉重的国家之一。CRC病因复杂,与遗传和环境有关。CRC的常规治疗方法是手术、化疗和放疗。早期CRC可通过手术治疗,但CRC早期症状不明显,难以发现和确诊。中晚期患者才多就诊,常因肿瘤太大或肿瘤转移而无法手术。化疗和放疗在杀伤癌细胞的同时,也会在一定程度上杀伤正常细胞,故常规放化疗具有一定的局限性。因此,寻找控制癌症发展、转移及恶化的新思路至关重要。早期CRC(Ⅰ和Ⅱ期)可通过手术治疗,5年内的相对生存率约为90%。因此,CRC的早期筛查与诊断对患者至关重要。一些炎症标志物,如粪便钙卫蛋白可作为诊断早期CRC潜在的生物标Medicaid expansion志物;上皮钙粘蛋白在粪便中的水平比在血清中更加敏感。然而,这些已知的标志物在灵敏度与特异性方面参差不齐,因此,CRC早期筛查仍需新的生物标志物。本研究通过生信分析筛选出金属转运蛋PD0325901白SLC39A8(Solute carrier family 39 member 8,SLC39A8)靶点,可能是一种新的生物标志物。SLC39A8是由SLC39A8基因编码的一种膜转运蛋白,可促进二价金属(如锌、铁)吸收,在结肠的正常组织与肿瘤组织中差异表达,且与CRC侵袭性相关。但是,SLC39A8在CRC发生和发展中的具体分子机制尚不清楚。生物信息学与网络药理学分析表明,香豆雌酚是能与SLC39A8结合的中药成分。香豆雌酚常见于葛根、苜蓿等中药,既往研究表明香豆雌酚可在抑制癌细胞增殖方面发挥作用。本研究通过香豆雌酚对结直肠癌细胞内SLC39A8基因表达的影响,观察香豆雌酚能否通过影响该基因的表达来达到抑制肿瘤增殖的目的,为临床用药以及新药研发提供理论依据。目的:基于生物信息学和网络药理学联合实验分析香豆雌酚干预结直肠癌的分子机制和关键作用靶点。方法:1.生物信息学和网络药理学筛选CRC预后靶点和中药成分及富集通路。从公共数据库选取结直肠癌数据集。采用单因素COX分析、临床相关性分析,筛选出在结直肠癌早期和晚期表达存在显著差异(P<0.05)的基因。将三组数据得到的基因(P<0.05)取交集,得到交集。对上述交集基因进行泛癌的差异分析、配对差异分析和生存分析,筛选出关键靶点。对其进行单基因临床相关性分析和独立预后分析。联合网络药理学预测与潜在靶点结合的中药有效成分。将筛选到的中药成分与潜在靶点进行分子对接,通过对核心靶点进行GO和KEGG富集分析,找出该基因所富集的通路,并以此为依据对药物分子发挥作用的机制进行合理推测。2.选择CRC细胞进行实验验证。体外培养人结直肠癌细胞COLO 205和HCT 116。采用不同剂量(0μM、25μM、50μM、75μM、100μM)香豆雌酚分别处理细胞24 h、48 h、72 h、96 h,通过CCK8实验检测香豆雌酚对COLO 205和HCT 116细胞增殖的影响;选择合适的药物浓度及处理时间,并设置对照组处理COLO 205和HCT 116细胞,确定香豆雌酚的给药浓度及作用时间。采用q RT-PCR和Western blot检测SLC39A8及铁死亡下游信号通路分子NCOA4、VDAC2、NOX2在m RNA和蛋白水平的表达变化。采用亚铁离子检测试剂盒观察香豆雌酚对细胞内亚铁离子含量的影响。利用流式细胞术检测香豆雌酚对上述细胞凋亡的影响情况。结果:1.生物信息学和网络药理学筛选结果。下载了3个结直肠癌数据集,共计1343例样品,其中正常样品60例,肿瘤样品1283例。根据对3个数据集进行单因素COX分析、临床相关性分析筛选,3个数据集共得到的4个交集基因,分别为GDI1、GPX3、NOS2和SLC39A8。通过泛癌的差异分析、配对差异分析和生存分析,最终筛选出关键基因SLC39A8。单基因临床相关性分析显示SLC39A8基因表达与淋巴结转移相关。单因素独立预后分析结果显示SLC39A8可以作为独立的预后因子。通过网络药理学筛选出与SLC39A8蛋白结合的中药成分香豆雌酚。分子对接结果显示,中药成分香豆雌酚与蛋白受体SLC39A8在理论上可以结合。GO富集结果显示SLC39A8可能参与铁离子跨质膜输入等生物学过程,其细胞学定位可能在溶酶体膜、质膜等,参与铁离子跨膜转运蛋白活性等分子功能。KEGG富集分析结果显示SLC39A8可能通过铁死亡通路发挥作用。2.CRC细胞实验验证结果。与对照组(0μM)相比,25μM、5CL139000μM、75μM、100μM浓度的香豆雌酚均可抑制COLO 205和HCT 116细胞的增殖,随着香豆雌酚浓度的提高及处理时间的增加,COLO 205和HCT116细胞的抑制率逐渐增加,且香豆雌酚对结直肠癌细胞的增殖的抑制呈现剂量依赖性及时间依赖性。结果显示浓度为100μM且作用时间为96 h,药物对细胞的抑制率最高。q RT-PCR和Western blot实验结果分别显示香豆雌酚显著激活了2种结直肠癌细胞系中SLC39A8及铁死亡通路相关基因NCOA4、VDAC2、NOX2的m RNA和蛋白表达。亚铁离子试剂盒实验结果显示香豆雌酚显著激活了2种结直肠癌细胞系内亚铁离子含量。流式细胞术实验结果显示香豆雌酚显著激活了2种结直肠癌细胞系的凋亡。结论:SLC39A8是结直肠癌预后关键基因,这种作用可能是通过调控SLC39A8、NCOA4、VDAC2和NOX2的铁死亡通路来实现的。香豆雌酚具有治疗结直肠癌的作用。