研究背景心房颤动(atrial fibrillation,AF)简称房颤,是心血管内科常见的快速型心律失常,因其发病诱因、机制繁多复杂,从而导致治疗效果不佳,出现较高的致残、致死率,成为目前心血管内科的重要难题。阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)已被列为房颤的独立危险因素,显著加剧了房颤的发生发展。既往研究表明,氧化应激是OSA诱发房颤的重要发病机制之一。机体处于氧化应激状态时,细胞内生成大量的活性氧物质,引起心肌重构,进而导致心肌纤维化和血栓栓塞。NADPH氧化酶(NADPH oxidases,Noxs)是心血管系统中活性氧的主要来源,有研究表明,在缺氧心肌细胞中,Nox4表达明显增加,活性氧产生增强,因此,通过药物调控心肌内Nox4表达活性,降低活性氧的生成,可减轻心肌的氧化应激损CB-839伤,亦或可为治疗OSA诱发型房颤提供新的切入点。硫化氢是继一氧化碳和一氧化氮之后发现的第三种新型气体信号分子。近年来,硫化氢在心血管系统中的作用也日益突出,通过抗炎、抑制氧化应激及改善心肌重构等各种机理,对心肌细胞发挥保护作用。但是,关于硫化氢在房颤中的研究仍少见。本研究通过建立大鼠急性阻塞性睡眠呼吸暂停诱发房颤模型并给予硫化氢外源性供体硫氢化钠干预,从氧化应激角度探讨硫氢化钠改善OSA诱发型房颤的可能机制,以期为房颤的治疗拓展新的思路。研究目的本研究旨在探索硫化氢改善阻塞性睡眠呼吸暂停诱发房颤的机制,通过建立急性阻塞性睡眠呼吸暂停诱发房颤大鼠模型,并给予硫化氢外源性供体硫氢化钠干预,从氧化应激角度出发,阐明硫氢化钠改善急性阻塞性睡眠呼吸暂停诱发型房颤的可能机制,以期为房颤的治疗拓展新的思路。研究方法1、随机选取36只健康雄性8-12周龄的SD大鼠,随机分为三组,对照组(Con组)、模型组(OSA组)和硫氢化钠干预组(Na HS组),每组12只。2、硫氢化钠组按每只大鼠体质量予以硫氢化钠溶液行腹腔注射(48μmo L/kg,0.9%氯化钠注射液配制,即配即用,均分于多个时间点注射,实验开始时给予一次药物注射,之后每间隔1小时重复给药,直至药物注射完毕),对照组和模型组予以等比例等时间点腹腔注射生理盐水。3、各组大鼠均在麻醉状态下行气管插管,模型组和硫氢化钠组采用循环憋气法模拟OSA过程(憋气40 s,恢复正常通气5 min20 s,6 min为1个循环,共60个循环,全程持续6 h),对照组正常通气。连接标准肢体导联连续记录体表心电图。于大鼠右侧颈静脉植入电极至高位右心房,当多导心电生理仪上显示出清晰的大A波小V波,说明心房电极植入成功。应用电生理刺激仪进行程序电刺激,该程序刺激包括8个连续性刺激(S1-S1=120 ms),而后给予一个早搏刺激(S2-S2)。S1-S2间期从最初设置的100 ms以5 ms的幅度递减,观察电生理仪波形,当临近有效不应期时,改为以2 ms的幅度递减,直到测得最初心房有效不应期,然后将S1-S2间期改为较有效不应期短5ms进行实验,模型组和硫氢化钠组进行夹闭气管插管40 s模拟OSA实验,OSA即刻以S1-S2间期为较有效不应期短5 ms的参数下进行程序刺激,每间隔2 s给予一次刺激,直至出现传导反应或房颤波形,且持续时间大于3 s时,将S1-S2继续缩短2 ms,再次行程序刺激,若出现房颤波形,待房颤状态自行终止,并恢复窦性心律后再行程序刺激,周而复始,至1次OSA结束,电刺激结束时测得最终心房有效不应期。实验结束后采集血液及左心房组织,测定相应生化指标。4、全程记录心脏电生理过程,分析各组大鼠心房有效不应期、心房颤动诱发率、心房颤动持续时间变化。5、采用硫代巴比妥酸法检测血清中丙二醛(MDA)含量;采用黄嘌呤氧化酶法检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力。6、采用Western blotting法检测心房组织中NADPH氧化酶4(Nox4)和缝隙连接蛋白43(Cx43)、CollagenⅠ、Fibronectin、MMP2蛋白的表达水平。7、取左心房组织,固定切片,采用苏木素-伊红(HE)染色观察心房肌细胞的结构变化;采用Masson染色观察组织的纤维化程度。研究结果1、成功构建急性阻塞性睡眠呼吸暂停诱发房颤大鼠模型通过构建急性OSA诱发型房颤大鼠模型,对照组(n=12)、模型组(n=12)、硫氢化钠组(n=12),对照组电生理刺激前后均显示窦性心律,未诱发房颤;而OSA状态下的模型组及硫氢化钠组则可诱发出房颤。由此说明,模型组与硫氢化钠组循环憋气法造模成功。2、硫氢化钠改善阻塞性睡眠呼吸暂停诱发房颤与对照组比较,模型组心房有效不应期缩短,房颤诱发率明显增加且持续时间明显延长,通过硫氢化钠干预后心房有效不应期显著延长,且房颤诱发率及持续时间明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)3、硫氢化钠抑制Nox4蛋白改善阻塞性睡眠呼吸暂停诱发房颤氧化应激损伤与对照组相比,模型组左心房组织中NADPH氧化酶4表达增高,丙二醛含量增加、超氧化物歧化酶活力降低,伴随缝隙连接蛋白43的表达降低,CollagenⅠ、Fibronectin、MMP2蛋白表达增高,通过硫氢化钠干预后,NADPH氧化酶4表达抑制,丙二醛含量降低、超氧化物歧化酶活力增加,缝隙连接蛋白43表达增加,CollagenⅠ、Fibronectin、MMP2蛋白表达降低(P均<0.05)。4、各组心肌组织形态学观察比较分别对各组大鼠左心房组织固定切片,苏木素-伊红染色结果显示对照组心房肌细胞排列紧密整齐,心肌细胞的结构完整,细胞核大且边界清晰;模型组可观察到心肌细胞排列紊乱,核固缩;通过硫氢化Biosynthesis and catabolism钠干预后,症状稍缓解。Masson染色显示与对照组相比,模型组组织间隙中有明显胶原沉积,通过硫氢化钠干预后,症状稍缓解。研究结论硫化氢可减轻阻塞性睡眠呼吸暂停诱发房颤心脏氧化应激损伤,从而降低房颤的发生维持,其作用PS-341机制与抑制NADPH氧化酶4蛋白激活,清除体内氧自由基,抑制脂质过氧化,继而上调缝隙连接蛋白43表达,改善心肌纤维化,并与有效抑制心房电重塑、结构重塑密切相关。