近年来,心血管疾病的发病率在世界范围内显著增加,寻找有效、安全的溶栓药物已成为心血管疾病研究领域的方向之一。纳豆激酶因其强大的溶栓活性被认为是一种新型的潜在溶栓药物,但纳豆激酶催化过程中能量和结构变化信息尚未明确且热稳定性较差,阻碍了其在医药领域的应用。在蛋白质工程中,分子动力学(MD)模拟可以探究系统中分子之间的相互作用和运GSK1349572供应商动。随着计算机性能的提高和计算方法的AIT Allergy immunotherapy改进,量子力学/分子力学组合(QM/MM)方法已被广泛应用于建立酶催化反应机理模型。为探究纳豆激酶催化反应过程的详细信息,本研究对纳豆激酶-四肽底物复合体进行QM/MM结合伞形采样模拟。运用MM/GBSA方法计算结合自由能,并对自由能进行分解,得到每个氨基酸残基对结合能的贡献。模拟结果表明,在纳豆激酶催化反应中,Ser~(221)中的羟基质子转移到His~(64)中咪唑环3号位的氮原子处,增强了Ser~(221)的亲核能力,形成中间体,其体系能量为3.9 kcal/mol。His~(64)与Asp~(32)之间形成氢键以稳定His~(64)。Asn~(155)作为纳豆激酶的氧阴离子空穴,在过渡态中与底物肽键中的氧形成氢键。为筛选和构建具有更高耐热性的纳豆激酶突变体,本研究通过基于自由能的方法得到热稳定性提高的纳豆激酶潜在突变体,并通过分子动力学模拟对其进行筛选,结合相关实验分析得到了三个有活性、能够提升纳EPZ-6438 MW豆激酶热稳定性的突变体,分别为E156F、Q206L和Y256P。将这三个突变体在更高温度体系下进行分子动力学模拟,分析上述三个突变体热稳定性提升的内在机理。结果表明将位于或靠近酶的表面的亲水氨基酸突变为疏水氨基酸可以增强纳豆激酶的热稳定性,同时较低的均方根偏差(RMSD)、回旋半径(Rg)、溶剂可及表面积(SASA)、活性口袋附近刚性氨基酸残基增加等,均为提升纳豆激酶热稳定性的因素。综上所述,本文做了以下创新性的工作:(1)明确纳豆激酶催化反应过渡态的能量和结构变化信息。(2)发掘能提高热稳定性的纳豆激酶突变体并提出突变体提升热稳定性的内在机理。