研究目的:已有研究表明,运动后血液同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平升高,急性剧烈运动后Hcy升高更显著,经常训练的运动员群体血液中的Hcy水平显著超出正常水平,被称为运动导致的高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)。血液Hcy过高会引起血管内皮细胞损伤和功能障碍,是导致血管粥样硬化、脑卒中等心血管疾病的独立危险因素。维生素B9(叶酸)能够降低血液中同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平,减少血管炎症和卒中风险。人体自身无法合成叶酸,只能从食物中获取。已知基因型是影响叶酸吸收和Hcy降低的重要影响因素。MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRRA66G是最常见的三个单核苷酸多态性(SNP)位点,影响叶酸代谢酶的活性,进而影响血液中Hcy的降低。在我国汉族人群中,上述基因突变率显著高于西方人。因此,我国运动人群中应有更多人存在运动相关HHcy风险,危害他们的心脑血管健康。针对现在核酸检测普遍操作繁琐、需要专业实验室和专业操作人员的缺点,本研究利用全基成的微流控基因芯片技术,建立了无创伤、全自动、免人工操作、不需要专业人员的叶酸代谢基因型检测技术和系统,能够安装在体育场馆、学校、甚至运动现场附近,使运动人员能够方便、快速、准确地把握自身的叶酸代谢能力,进而开展精准的运动营养补充,防范运动相关HHcy风险和心血管疾病风险。研究方法:基于无创伤、全自动、免人工操作的基因检测系统,来实现叶酸代谢基因型的检测。主要技术内容包括:环介导的核酸恒温扩增(LAMP,Loop-mediated isothermal Amplification)技术,核酸扩增的可视化检测技术,全集成的微流控基因芯片技术。本基因检测系统由核酸提取模块、扩增模块和检测分析仪组成。核酸提取模块中样本细胞被裂Bafilomycin A1小鼠解,DNA被捕获并通过硅胶膜洗脱。在核酸扩增模块捕获的DNA与LAMP试剂进行混合,后注入检测芯片进行扩增反应。分析仪实现检测结果的自动判断,由三个模块组成:气路模块、加热模块和光学扫描模块。系统完全自动化操作,实现了”样本输入-应答-输出”的检测模式。目标基因序列由美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得,使用SnpGene软件针对MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRRA66G位点设计LAMP引物,引物由生工生物(上海,中国)合成。采用口腔拭子获取检测样本。利用环介导等温扩增(LAMP)技术检测多个基因位点,等温扩增检测反应程序为恒温65℃,45min。利用染料实现核酸扩增检测结果的可视化,反应室的颜色表示是否存在基因扩增,如果存在基因扩增,阳性反应后试剂的颜色从紫色变为绿色。通过对比反应前后试剂颜色进行SNP位点的判断。每个SNP位点需要两个反应腔进行检测,分别检测突变型和野生型,若两检测腔颜色都变为绿色,则说明该基因型为杂合子。使用PCR加一代测序技术作为金标方法开展对比测试,验证本系统的检测准确性。PCR检测体系为:缓冲液、引物、热启动酶(Hot start enzyme)、DNA模板和无核酸水。反应程序为:95℃进行5min,94℃进行30s,60℃进行30s,72℃进行1min。PCR产物测序由生工生物(上海,中国)完成。测序结果使用BioEdit软件进行分析。在体育高校招募受试者,要求具有一定的运动等级或经常进行体育活动,存在运动致HHcy的风险。采集受试者口腔拭子样本,使用建立的全自动基因检测系统进行MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRRA66G基因位点基因检测。统计基因型分布以及各基因突变率,分析潜在HHFc-mediated protective effectscy风险。研究结果:通过与基因测序结果对比,本研究搭建的全自动基因检测系统的灵敏度和特异性表现良好,并且基因芯片室间无交叉污染,SNP位点的分型检测的灵敏度达到300 copies/μl。完成26名运动人员的MTHFR MTRR全自动基因检测。26人成功检出,结果与基因测序结果一致。MTHFR C677T基因CC野生型4人,CT杂合型10人,TT突变型12人,C等位基因的频率为0.364,T等位基因的频率为0.654;MTHFR A1298C基因AA野生型21人,AC杂合型1人,CC突变型4人,A等位基因的频率为0.827,C等位基因的频率为0.173;MTRR A66G基因AA野生型24人,AG杂合型2人,无GG突变型,A等位基因的频率为0.962,G等位基因的频率为0.038。风险基因型MTHFR C677T位点TT型12人,MTHFR A1298C位点CC型4人,MTRR A66G位点AG型2人,只有一人同时有TT与AG基因型,其他个体均为单一位点突变风险。研究结论:利用全集成微流控基因芯片技术和可视化核酸简易检测技术,首次成功建立了对MTHFR、MTRR基因位点SNP的全自动基因检测体系,特异性好、灵敏Ferrostatin-1体内实验剂量度高。受试者基因突变率:MTHFR C677T>MTHFR A1298C>MTRR A66G。17名运动人员存在风险基因型,因此存在运动相关的HHcy风险以及心血管健康风险。上述人群的基因型特征表明,普通饮食已经无法满足需求,应在运动前服用叶酸补剂,来避免运动导致的血液中Hcy水平过高。本研究研发的叶酸代谢基因型全自动检测系统,实现了运动人员叶酸补充的精准化和个体化,在个性化精准运动营养领域,实现技术创新。