胃食管结合部癌是上消化道常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界范围内呈上升趋势。手术切除结合辅助化疗是胃食管结合部癌常用治疗策略。但是,术后复发的可能性较高,中晚期患者治疗后五年生存率仅为20%左右。预后较差。目前,一般把发生于胃食管交界线上下5cm区域以内的癌,称之为胃食管结合部癌。因其特有的解剖学、织学特点和临床表现,一般分为早期和进展期癌。早诊早治是目前综合防治胃食管结合部癌的主要措施。内镜检查是我国胃食管结合部癌使用最广泛的筛查手段。但是内镜检查存在效率低等缺点,不适合大范围人群中推广筛查。近年来,基于蛋白组学技术探索肿瘤发生发展机制,筛选肿瘤标志物,进行分子分型的研究逐渐增多,比如食管癌,胃癌,肝癌等等,然而针对胃食管结合部癌尤其是胃食管结合部癌前病变组学研究仍属空白,亟待建立胃-食管结合部病变发展阶段分子差异全景图,促进有效诊断标志物及药物靶点的发掘。然而,可长期稳定传代的肿瘤相关模型的缺少对胃食管结合部癌的研究造成了阻碍,类器官是具有器官特异性细胞组成的关键结构和功能特性培养物,能够部分甚至完全还原体内器官的细胞构成和结构功能,可以克服传统细胞系或动物模型无法模拟体内的肿瘤微环境限制。目前,已被广泛用于药物筛选、药物安全性测试、预测患者治疗反应。因此,本研究通过构建类器官来模拟体内的免疫微环境为后期研究提供重要的工具。总之,本研究利用基于质谱的蛋白质组学技术,绘制了胃食管结合部癌和癌前病变组织特异性的蛋白质组学图谱,筛选了PLOD3和CACYBP作为胃食管结合部早期癌变的候选标志物,CDK4作为胃食管结合部癌发生发展过程中的关键蛋白,为胃食管结合部癌的早诊早治提供重要的实验依据。第一部胃-食管结合部癌及癌前病变组织的蛋白质组研究及生物信息学分析目的:本研究旨在构建胃-食管结合部(Esophagogastric junction,EGJ)癌和癌前病变组织的特征性蛋白质组学图谱,探讨胃-食管结合部癌进展过程中的分子机制。方法:1.应用质谱分析技术筛选50对胃-食管结合部癌和50对癌前病变组织,及对应非病变组织中的蛋白质组的差异。2.应用加权基因共表达网络等生物信息学方法分析胃-食管结合部癌进展过程中差异表达的蛋白与临床病理信息之间的相关性。结果:1.蛋白质组学研究结果显示,在胃-食管结合部癌组织和癌前病变组织中共鉴定出9192个具有独特肽段的蛋白质,以差异倍数超过1.5,P<0.05,作为显著上调的变化阈值,与对应非病变组织相比,胃-食管结合部癌前病变组织中1121个蛋白上调,858个蛋白下调;与癌旁组织相比,胃-食管结合部癌组织中1442个差异蛋白上调,1093个蛋白下调。2.加权基因共表达网络分析结果显示,胃-食管结合部癌进展过程共分为9个蛋白模块,其中,蓝色和青色模块与临床病理信息密切相关。小结:本实验成功构建胃-食管结合部癌和癌前病变组织的特征性蛋白质组学谱图。并基于加权基因共表达网络分析聚类到9个与胃-食管结合部癌进展相关的蛋白模块。第二部分CACYBP、PLOD3和CDK4在胃-食管结合部癌和癌前病变组织中的表达及作为潜在标志物的初步研究目的:筛选胃-食管结合部癌潜在标志物,探讨其作为胃-食管结合部癌候选标志物的灵敏度和特异度。方法:1.应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)筛选早期胃-食管结合部癌的候选标志物。2.应用蛋白互作网络分析筛选参与胃-食管结合部癌发生发展中的关键蛋白。3.应用免疫组织化学技术验证PLOD3、CACYBP和CDK4在胃-食管结合部炎症、癌前和癌组织中的表达。4.应用TCGA、TIMER等多种数据库分析CDK4、CACYBP和PLOD3与免疫微环境的相关性。结果:1.ROC结果显示,PLOD3和CACYBP能明显区分非病变与病变组织,PLOD3和CACYBP联合应用有助于胃-食管结合部癌的早期诊断。2.蛋白互作网络分析结果显示,CDK1、CDK2、CDK4、LRRK2、ERBB2、MAPK13在胃-食管结合部癌变过程中显著升高,并且处于Hub网络核心位置。3.免疫组织化学染色实验结果显示,PLOD3、CACYBP在癌变组织中的表达高于对应非病变组织,阳性表达部位在肿瘤细胞的胞浆中。CDK4在胃-食管结合部癌和癌前病变组织中高表达,阳性表达部位在肿瘤细胞的胞核或胞浆中。4.TCGA、TIMER等数据库分析显示,CDK4的表达与肿瘤微环境中的CD4+T(CDR=-0.171,P=1.00e-03)细胞和B细胞(CDR=-0.367,P=3.47e-13)的浸润水平呈显著负相关关系;PLOD3的表达与B细胞(CDR=-0.176,P=7.06e-04),CD8+T细胞(CDR=-0.175,P=7.46e-04),巨噬细胞(CDR=-0.197,P=1.32e-04),中性粒细胞(CDR=-0.164,Preduce medicinal waste=1.49e-03),树突状细胞(CDR=-0.182,P=4.27e-04)的浸润水平呈显著负相关关系;CACYBP的表达与B细胞(CDR=-0.216,P=2.79e-05),CD4+T细胞(CDR=-0.26Ferrostatin-1体外6,P=2.35e-07),巨噬细胞(CDR=-0.17,P=1.04e-03)的浸润水平呈显著负相关关系。小结:PLOD3和CACYBP的联合应用有助于区分胃-食管结合部早期病变患者和健康人群。CDK4是胃-食管结合部癌发生发展中的关键蛋白。第三部分基于类器官(Patient Derived Organoid,PDO)细胞模型进行药物靶点研究目的:构建胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型进行药物筛选。方法:1.应用组织块法和酶消化法构建6株p38 MAPK抑制剂胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型,并进行传代培养。2.应用Western blot实验检测CDK4在6株胃-食管结合部癌PDO细胞模型中的表达。3.应用MTS细胞增殖实验,验证CDK4/6抑制剂帕博西尼(Palbociclib)对胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型增殖的影响,并分析其IC50值与CDK4蛋白表达的关系。结果:1.本次实验成功构建6株胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型,6株类器官均呈囊泡状结构,由单层上皮构成,上皮细胞间呈平行方向无规则排列。2.Western blot实验结果显示,CDK4在胃食管结合部癌细胞中高表达。3.药物敏感性实验结果显示,帕博西尼(Palbociclib)能够明显抑制PDO细胞增殖。并且CDK4的表达量与帕博西尼的IC50值呈负相关关系(相关系数为0.9678,p值为0.0004)小结:本研究成功构建6株胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型,帕博西尼可显著抑制胃-食管结合部癌PDO模型细胞的增殖,且CDK4表达量与帕博西尼的敏感性呈正相关关系。结论:本研究基于4D label free蛋白质组学技术,首次绘制了胃-食管结合部癌和癌前病变组织的特征性蛋白质组学图谱,为揭示胃-食管结合部癌动态演进分子机制提供了契机。PLOD3和CACYBP的联合诊断有助于早期胃-食管结合部癌的筛查。帕博西尼作为一类CDK4/6抑制剂,能够明显抑制胃-食管结合部癌类器官细胞的增殖。