为了研究地黄苯乙醇苷类成分生物合成的调控机制,对地黄全长转录组进行了测序,鉴定出参与苯乙醇苷类成分合成的MS-275试剂催化酶基因的序列,分析了催化酶基因的表达特性及其与毛蕊花糖苷合成的相关性。应用水杨酸(SA)及低温处理研究非生物诱导对地黄苯乙醇苷含量的影响和相关基因转录特性,测定了水杨酸和低温处理后地黄的生理生化指标变化、药效成分含量变化,并应用转录组测序技术分析了相关基因的表达模式。利用过量表达和基因编辑技术初步分析了RgWRKY35在地黄苯乙醇苷合成中的调控功能。主要研究内容如下:1.以地黄的叶、茎和块根为材料,利用Pacific Biosciences RS II平台进行全长转录组测序。共获得非冗余的转录本27 773条,平均长度2 380 bp,预测出27 236个CDS。利用BLAST等软件在NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro等数据库共预测到27399个注释的基因。NR注释表明,与地黄转录本匹配数量最多的是芝麻,有81.44%。推测了参与异毛蕊花糖苷、松果菊苷、肉苁蓉苷A、肉苁蓉苷F、2-乙酰毛蕊花糖苷和Leonoside F生物合成的催化酶,并鉴定出143个参与苯乙醇苷类成分生物合成的转录本。19个催化酶基因在地黄12个组织中与毛蕊花糖苷的含量呈正相关,embryonic culture media其中多数基因在叶和花中具有较高的表达量。2.以地黄栽培品种温85-5为材料,用SA喷施生长180 d的地黄植株,在处理后的0h、1 h、3 h和6 h收集地黄叶片和块根,测定毛蕊花糖苷及总苯乙醇苷的含量,并对SA处理后不同时间的块根进行转录组测序分析。结果显示,SA处理后地黄叶片中的毛蕊花糖苷提高了11.2～19.3%,块根中毛蕊花糖苷的含量提高了0.9～1.4倍。叶片中的总苯乙醇苷含量在SA处理后6 h比对照提高28.5%,块根中总苯乙醇苷含量在处理后分别比对照提高了0.65～0.82倍。转录组分析表明,苯乙醇苷生物合成通路在差异表达的基因中得到显著富Empagliflozin molecular weight集,ALDH基因、UGT基因和PPO等少数毛蕊花糖苷合成途径的催化酶基因在SA处理后的地黄块根中上调表达。筛选并鉴定出多个在SA处理后差异表达的AP2-EREBP、WRKY和MYB转录因子基因。3.利用人工智能气候箱对地黄品种QH-1和BZY进行不同温度处理,在5°C和15°C处理下地黄叶片中的抗氧化酶活性呈先升高后下降的趋势,脯氨酸含量先上升后降低,可溶性糖含量整体上呈上升趋势。测定了不同温度处理后地黄有效成分含量的变化,结果表明,适度低温促进总苯乙醇苷和毛蕊花糖苷含量的积累。对低温胁迫的地黄叶片进行转录组测序,结果显示低温胁迫后差异表达的基因主要富集在淀粉与蔗糖代谢、单萜生物合成、吲哚生物碱生物合成、类胡萝卜素生物合成、类黄酮生物合成等代谢通路。分析了低温处理后富集到苯乙醇苷生物合成通路的催化酶基因表达特性,筛选了响应低温参与苯乙醇苷和梓醇合成的候选基因,分析了低温处理后类黄酮生物合成途径差异表达的基因。4.利用聚合酶链式反应技术(PCR)克隆了地黄RgWRKY35基因,其编码区序列(CDS)长度894 bp,编码297个氨基酸。多序列联配表明RgWRKY35具有典型的WRKY结构域。亚细胞定位分析发现RgWRKY35蛋白分布在细胞核中,属于核蛋白。利用农杆菌介导法将RgWRKY35基因的过量表达载体和基因编辑载体导入地黄基因组,获得了过量表达和基因编辑的转化地黄植株。过量表达RgWRKY35基因的地黄株系毛蕊花糖苷含量显著升高,基因编辑RgWRKY35的地黄株系毛蕊花糖苷含量显著降低,表明RgWRKY35基因是地黄苯乙醇苷类成分毛蕊花糖苷的正向调控因子。