面对严重危害生命健康的癌症,新兴的免疫治疗展现出了广阔的前景,特别是肿瘤免疫景观的完善促使以T细胞为基础的免疫疗法进入研究者的目光中,并展现出强大的治疗潜力。T细胞的免疫反应在肿瘤免疫循环中举足轻重,在经历识别抗原、激活分化、浸润肿瘤几个主要步骤后,T细胞在肿瘤环境中启动特异性杀伤机制。因此,免疫治疗基于激活免疫系统来杀伤肿瘤的基本目的,衍生出了如肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂等多种疗法。但不幸的是,肿瘤存在复杂且多样的免疫抑制及免疫逃逸机制。在抗原呈递过程中,肿瘤细胞发展出了多种途径来避免抗原的释放与摄取,导致T细胞的激活信号不足。即使T细胞激活并浸润肿瘤后,高表达的免疫检查点又会向T细胞释放抑制信号,使T细胞无法发挥作用。同时在肿瘤微环境中缺氧、低糖、慢性抗原等独特条件的影响下,T细胞的线粒体受到损伤并无法被清除,这些积累的去极化线粒体迫使T细胞产生耗竭重编程,最终走向完全丧失效应性的终末耗竭T细胞的命运。这些限制因素使得肿瘤部位的T细胞往往只能有心无力,失去杀伤力,这是导致目前临床免疫疗法响应性不理想的主要因素之一。针对免疫原性不足、T细胞耗竭和程序性死亡受体1(PD-1)诱导免疫逃逸等关键问题,我们设计了一种可注射水凝胶O-TL@(N+S)。O-TL@(N+S)是基于肿瘤裂解物(TL)构筑的水凝胶,首次使用氧化海藻酸钠(OSA)作为交联剂对TL进行化学修饰,然后包载烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)前体药物烟酰胺核糖(NR)和糖原合酶激酶3(GSK-3)抑制剂SB415286。其中O-TL能够在体内钙离子作用下瘤内原位形成水凝胶,形成抗原库,诱导强免疫原性;与此同时,NR可以诱导T细胞发生线粒体自噬,清除去极化线粒体,抑制耗竭;而SB415286则通过GSK-3通路基因效应抑制PD-1表达,阻止免疫逃逸。三者联合原位调节免疫细胞,增强基于T细胞的肿瘤免疫,达到高效抑制肿瘤的效果。本课题主要研究内容如下:1.通过化学反应成功合成制备OSA及O-TL,最终得到O-TIDN-6556使用方法L@(N+S)。该制剂在钙离子存在下具有良好的成胶性能,同时具备通针性,可用于体内注射成胶。而体内皮下注射也证实了这一点,同时还显示水凝胶在体内具有可降解性。O-TL@(N+S)形成的水凝胶呈现经典网状结构。在模拟瘤内环境的释放介质中,O-TL@(N+S)可以按稳定的速率持续释放出活性物质,是原位递送药物的潜在治疗平台。溶血实验和细胞毒性实验则证明水凝胶对于正常细胞无显著副作用,初步证明制剂安全性。2.提取并激活小鼠髓源树突状细胞(BMDCs)和CD8+T细胞作为对象,体外探究O-TL@(N+S)的免疫调节能力。细胞成熟实验发现O-TL@(N+S)水凝胶可以有效刺激DCs成熟,参与后续免疫启动;细胞募集实验结果表明水凝胶可以促使DCs向凝胶部位募集,增加局部DCs数量。另一方面,CD8+T细胞的流式结果显示O-TL@(N+S)水凝胶能够降低去极化线粒体的比例从而抑制耗竭重编程;同时降低了 T细胞表面PD-1的表达量,阻断PD-1/PD-L1通路;通过抑制耗竭、阻断PD-1信号等机制大大提升了 T细胞增殖能力。ELISA实验结果显示T细胞在水凝胶处理后,IFN-γ分泌量显著增加,进一步证明T细胞功能被增强。共孵育体系中B16F10细胞的凋亡结果直接揭示了 O-TL@(N+S)处理后的T细胞能够更有力地杀伤肿瘤细胞。3.构建B16F10的小鼠荷瘤模型评估O-TL@(N+S)的体内免疫调节能力及由此产生的抑瘤效果。活体成像实验首先证实凝胶在药物瘤内滞留方面的优势。双边瘤实验体现了水凝胶能够显著抑制原位及远位肿瘤的生长,同时无毒副作用;流式分析、免疫荧光图像及ELISA测定结果说明O-TL@(N+S)水凝胶引起了强大的原位免疫应答以及系统性免疫。肺转移实验证实O-TL@(N+S)水public health emerging infection凝selleck产品胶能够通过激活原位免疫反应发挥远位效应,从而抑制肿瘤肺转移,延长生存期。记忆模型结果显示O-TL@(N+S)水凝胶可以诱导小鼠长期免疫反应。综上,本课题设计了一种可注射肿瘤裂解物水凝胶O-TL@(N+S),瘤内注射后原位成胶,通过持续释放活性物质诱导免疫原性、抑制耗竭重编程及抑制PD-1表达,调节免疫细胞以增强抗肿瘤免疫治疗,并成功抑制了肿瘤生长、转移及复发,产生了强大且持续的免疫效果。本课题基于肿瘤裂解物构建可注射水凝胶调节T细胞杀伤效率为肿瘤免疫治疗开辟了新的途径。