卵巢是一个高度动态的器官,卵泡是卵巢上的基本的功能单位,在每一个发情周期中,卵巢都会经历一次重塑过程,这个过程包括卵泡的招募、生长、优势化或闭锁。卵巢卵泡的发育受到内分泌及旁分泌的调节,研究猪卵泡的发育对更好地理解母猪的生殖机理及进一步提高母猪繁殖力具有重要的意义。卵泡液是卵泡生殖细胞和卵泡体细胞共同生存的环境,卵泡液中存在着大量的无机盐及各种营养物质,卵泡液能够保障卵泡细胞间的交流。外泌体是一种直径在40～200nm之间的细胞外囊泡,外泌体可以通过携带和转运蛋白质、RNA和脂质等物质来实现细胞间通讯。目前,在各种大型家养动物的卵泡液中都发现了外泌体,外泌体是一种参与调解细胞生理状态的的重要物质,但是外泌体对卵泡细胞的影响及作用尚不完全明确,本研究以猪卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞为实验对象探究卵泡液外泌体对卵泡细胞的影响,主要研究内容及结果如下:1.卵泡液外泌体的分离、鉴定、标记及示踪本实验采用超速离心过滤法从猪卵泡液中分离卵泡液外泌体,使用透射电子显微镜、纳米粒子示踪技术及外泌体关键标志性蛋白检测来鉴定所分离外泌体的纯度。结果显示,本实验使用的超速离心过滤法分离出的卵泡液外泌体具有外泌体的典https://www.selleck.cn/products/carfilzomib-pr-171.html型特征,并且分离出的外泌体具有较高的纯度。为了探究卵泡液外泌体的作用机制,本实验使用PKH26标记卵泡液外泌体,并将被标记的卵泡液外泌体与颗粒细胞或卵泡膜细胞共同孵育,激光共聚焦结果显示,卵泡液外泌体能被颗粒细胞和卵泡膜细胞吞噬,进一步研究发现这一吞噬作用可以被氯丙嗪所阻断,这一结果表明卵泡液外泌体是通过网格蛋白所介导的内吞作用进入卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞内。2.卵泡液外泌体对卵泡颗粒细胞增殖和类固醇激素合成的影响本实验使用梯度浓度的卵泡液外泌体处理卵泡颗粒细胞,并使用CCK-8进行细胞活力检测,实验结果表明120μg/m L的卵泡液外泌体能够极显著促进卵泡颗粒细胞的活力。因此后续实验使用120μg/m L的卵泡液外泌体处理卵泡颗粒细胞,然后对卵泡颗粒细胞进行转录组学测序。测序结果发现部分差异基因与卵泡颗粒细胞增殖和类固醇合成相关。研究发现,卵泡液外泌体能够促进卵泡颗粒细胞增殖相关基因CCND1和类固醇合成相关基因HSD3B1表达,进而极显著促进卵泡颗粒细胞增殖和孕酮合成。研究发现,ICG-001能够阻断外泌体对CCND1和HSD3B1表达的调控作用,这表明WNT/B-CATENIN信号通路参与了外泌体对CCND1和HSD3B1表达的调控作用。mi RNA测序结果显示,大量的mi RNA在卵泡液外泌体中富集,mi RNA-m RNA靶向分析发现SFRP4是mi R-31-5p的潜在靶点。通过在颗粒细胞中过表达或抑制mi R-31-5p发现,mi R-31-5p能够通过抑制SFRP4的表达激活WNT/B-CATENIN信号通路促进颗粒细胞增殖和孕酮合成。因此得出结论:卵泡液外泌体递送mi R-31-5p抑制SFRP4的表达进而激活WNT/B-CATENIN信号通路促进卵泡颗粒细胞增殖和孕酮合成。3.卵泡液外泌体对卵泡膜细胞抗氧化应激、增殖和类固醇合成的作用。本实验使用梯度浓度的外泌体处理卵泡膜细胞,并使用CCK-8进行细胞活力检测,实验结果表明120μg/m L的外泌体能够极显著促进卵泡膜细胞的活力。因此后续实验使用120μg/m L的卵泡液外泌体处理卵泡膜细胞,然后对卵泡膜细胞进行转录组学测序。测序结果发现部分差异基因与抗氧化应激、增殖和类固醇激素合成有关。进一步研究发现,卵泡液外泌体能够通过直接递送GPX1蛋白和促进卵泡膜细胞中GPX1的表达来增强卵泡膜细胞抗氧化应激的能力。研究还发现,卵泡液外泌体能够促进卵泡购买R428膜细胞增殖相关基因CCND1和PCNA及类固醇合成相关基因CYP11A1和HSD3B1的表达,进而促进卵泡膜细胞的增殖及孕酮和雄烯二酮的合成。4.卵泡液外泌体对卵泡颗粒细胞趋化因子分泌的影响分析以上2和3实验中Saliva biomarker的转录组测序结果发现,卵泡液外泌体能够促进卵泡膜细胞和颗粒细胞中趋化因子CCL2和CXCL8 m RNA的表达,因此本实验以卵泡颗粒细胞为研究对象探究了卵泡液外泌体对卵泡细胞趋化因子分泌的影响。结果表明,卵泡液外泌体能够抑制颗粒细胞BDNF的表达、促进颗粒细胞趋化因子CCL2和CXCL8的分泌;进一步实验发现,体外添加BDNF能够抑制颗粒细胞趋化因子CCL2和CXCL8的分泌,使用si-BDNF内源性敲低BDNF能够促进颗粒细胞趋化因子CCL2和CXCL8的分泌。mi RNA测序结果表明mi R-10b-5p在卵泡液外泌体中富集,通过mi RNA-m RNA靶向分析发现BDNF是mi R-10b-5p的潜在靶点。通过在颗粒细胞中过表达或抑制mi R-10b-5p发现,mi R-10b-5p能够通过抑制BDNF的表达来促进颗粒细胞趋化因子CCL2和CXCL8的分泌。因此得出结论:卵泡液外泌体递送mi R-10b-5p抑制BDNF的表达进而促进颗粒细胞趋化因子CCL2和CXCL8的分泌。总的来说,本研究发现卵泡液外泌体能够通过促进卵泡体细胞增殖、激素合成和抗氧化等功能保障卵泡的正常发育,并且能够促进卵泡细胞分泌趋化因子招募免疫细胞为排卵发生做准备,外泌体功能的研究为揭示卵泡发生提供了一些新的理解及新的机制。