单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)为革兰阳性兼性胞内寄生菌,可引起人兽共患李斯特菌病,具有较高的致死率。Lm主要通过胃肠道感染,能够耐受胃部的酸性环境以及肠道的弱碱性环境,抵抗蛋白酶、胆盐以及宿主免疫系统等。其中,Lm对肠道胆盐的耐受能力是其突破肠道屏障并感染宿主的重要条件。因此,揭示Lm参与胆盐胁迫的机制,有助于阐明其感染与致病的分子机制。为此,本研究以从暴发李斯特菌病例的羊脑中分离的强毒菌株Lm XYSN为材料,通过对其转座子突变库的筛选挖掘与胆盐耐受相关基因,并构建相应基因的缺失株,对其生长速率、生物被膜形成能力、形态变化等生物学特征进行研究。此外,分别以Caco-2BBe细胞系和小鼠作为体内和体外感染模型,测定了靶基因对细菌毒力的影响。最后,通过转录组学测序以及荧光定量PCR,探究了 LMxysn_0254基因的调控网络。本研究为Lm耐受胆盐胁迫机制提供了新的认知,同时为揭示强毒株Lm XYSN的致病机制奠定了理论基础。1.单核细胞增生李斯特菌胆盐耐受相关基因筛选胆盐作为一种两性物质,具有促使细胞破裂、损伤大分子物质、螯合金属离子等抑菌功能,在抵御Lm入侵宿主的过程中发挥重要作用。本研究在含0.2%胆盐-BHI条件下对1041株Lm XYSN的转座突变子进行筛选,以生长速率低于Lm XYSN 50%作为判定标准,共获得30株胆盐敏感菌株,利用二Z-VAD-FMK半抑制浓度轮PCR方法确定转座子插入位点。对所获基因进行生物信息学预测分析,发现蛋白功能为未知的假定蛋白(37%)、运输相关的转运蛋白(20%)或信号传导相关的调控因子(13%)等。2.单核细胞增生李斯特菌胆盐耐受相关基因生物学特性研究为探究筛选获得的胆盐耐受相关基因的功能,选取LMxysn_0254、LMxysn_1966、LMxysn_0808和LMxysn_2902四个基因进行了研究。通过同源重组技术成功构建了XYSNΔ0254、XYSNΔ1966、XYSNΔ0808与XYSNΔ2902缺失株,并对其生物学特性进行了测定。生长曲线测定结果显示,在0.2%胆盐胁迫条件下,LMxysn_0254、LMxysn_0808与LMxysn_1966基因有利于细菌维持正常生长速率。生物被膜测定结果表明,在0.2%胆盐-BHI培养基中,LMxysn_0254有利于不同温度下细菌形成生物被膜。XYSNΔ1966在37℃与42℃下生物被膜形成能力减弱。XYSNΔ2902仅在42℃下生物被膜的形成显著降低。此外,对缺失株形态学进行观察,可以发现XYSNΔ0254的细菌长度发生明显增长现象。以上结果表明LMxysn_0254以及LMxysn_0808基因与Lm生长过程密切相关,LMxysn_0254、LMxysn_1966以及LMxysn_2902基因参与胆盐条件下Lm生物被膜的形成,利于Lm抵抗胆盐的胁迫。本研究以人结肠腺癌Caco-2 BBe细胞为体外感染模型,对胆盐耐受相关基因在Lm粘附和侵袭中的作用进行了探究。结果显示LMxysn_0254、LMxysn_1966与LMxysn_0808基因增强了 Lm对CIgG2 immunodeficiencyaco-2 BBe细胞的黏附能力。细菌在C57BL/6N小鼠脏器中的定殖能力测定结果显示,LMxysn_0254、LMxysn_0808与LMxysn_2902基因促进了 Lm在回肠中的定殖。其中,LMxysn_0254基因还参与了 Lm在脾脏与胆囊的定殖过程。LMxysn_0808基因有利于Lm对肝脏、脾脏的侵袭和感染。这些结果提示,筛选到的四个基因均与Lm的毒力相关,其中LMxysn_0254在Lm XYSN抵抗胆盐胁迫中发挥更为重要的作用。3.LMxysn_0254基因参与胆盐耐受的分子调控机制为了解析LMxysn_0254基因参与Lm XYSN抵抗胆盐胁迫及毒力的机制,对BHI以及含0.2%胆盐-BHI条件下的野生株与XYSNΔ0254进行转录组学测分析。通过比对分析可知,LMxysn_0254基因缺失后,编码Clp蛋白酶家族基因发生显著上调。而hly、actA、plcA与plcB等毒力基因均发生显著下调。使用qRT-PCR检测胆盐水解酶的bsh基因、调控基因brtA、sigB与prfA均下调表达。依据上述结果,本研究对LMxysn_0254基因调控网络进行绘制。上述分析提示,LMxysn_0254基因通过网络调控Lm胆盐耐受与毒力等相关基因的表达为了进一步研究LMxysn_0254基因参与胆盐耐受的分子调控机制,成功构建了该基因的回复株XYSNΔ0254::0254,对缺失株、回复株与野生株的生物学特性进行了测定。扫描电镜观察结果证实,多数XYSNΔ0254不能正常分裂,呈链状排列。在胆盐胁迫条件下,XYSNΔ0254生长速率显著降低,生物被膜形成能力缺陷。利用C57BL/6N小鼠作为体内感染模型对Lm XYSN、XYSNΔ0254以及XYSNΔ0254::0254毒力进行评估,结果显示XYSNΔ0254在胆囊、脾脏和回肠中的定殖能力均显著降低,差异倍数分别为50倍、31倍以及10倍。以上结果表明LMxysn_0254基因参与了细菌的分裂以及生物被膜形成,有利于Lm XYSN在胆盐环境中生存。此外,促进了 Lm黏附、侵袭能力,增强了 Lm在肠道、胆囊和脾脏中的定殖能力。综上所述,在胆盐胁迫条件下对转座子突变文库进行了多轮筛选,获得30株对胆盐敏感的转座突变株。基于插入位点基因定位与生物信息学分析,对LMxysn_0254、LMxysn_1966、LMxysn_0808和LMxysn_2902基因的功能开展了初步研究。除LMxysn_0808基因之外,其他三个基因均能增强Lm在胆盐胁迫条件下生物被膜的形成,且LMxVP-16分子式ysn_0254、LMxysn_0808和LMxysn_2902都能促进Lm在小鼠肠道中的定殖。其中LMxysn_0254基因能调控毒力基因与胆盐耐受相关基因的表达,有助于细菌生长与正常分裂,促进该菌在宿主肠道、胆囊和脾脏中的定殖能力,在细菌对宿主的感染与致病中发挥极为重要的调控作用。本研究为揭示Lm抵抗胆盐胁迫的分子机制奠定理论基础。