研究背景作为主要纳米材料的碳纳米管(Carbon nanotube,CNT),有着优越的理化特性,近年来广泛应用于各行各业,在生产、运输、贮存等各个环节都会产生CNT纳米颗粒,增大职业人群暴露的潜在机会,对职业人群的健康产生潜在危害。职业环境中,CNT主要通过呼吸道进入人体,吸入的颗粒可在肺部沉积,对呼吸系统造成包括降低肺功能、诱发肺部炎症和肺纤维化等损伤。CNT中的单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotube,SWCNT)比多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotube,MWCNT)应用更为广泛,且课题组前期研究发现SWCNT较MWCNT具有更强的促病变能力,因此,识别、评价、预测和控制SWCNT对职业人群的健康危害是公共卫生研究的重要工作之一。目的1、通过对SWCNT暴露诱导肺损伤小鼠肺组织的单细胞RNA测序分析,阐明SWCNT诱导的小鼠肺组织炎症和纤维化与中性粒细胞群集的关系。2、采用动物实验结合体外细胞研究,通过对G蛋白偶联受体(G Protein-coupled Receptor,GPCR)敏感性的调节揭示GPCR敏感性增强或脱敏调控中性粒细胞群集,介导SWCNT诱导小鼠肺部炎症和纤维化的机制。3、利用单细胞RNA测序结果的富集和功能分析、GPCR脱敏调节剂,以及Si RNA干扰等手段,探讨GPCR调控SWCNT诱导中性粒细胞群集的分子机制。研究方法1、SWCNT诱导小鼠肺组织炎症和纤维化与中性粒细胞群集的关系8-10周龄C57BL/6J雌性小鼠随机分为对照组、SWCNT组,通过气管滴注分别给予磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)、40μg/只SWCNT,处理1天、3天、7天、28天和56天后进行肺功能检测,取小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)提取中性粒细胞,进行形态、数量、功能、GPCR敏感性等评价,处死小鼠取肺组织检测炎症和纤维化,以及单细胞RNA测序。分析小鼠肺功能、肺组织炎症和纤维化与中性粒细胞群集的关系,并对单细胞RNA测序结果进行细胞亚群、细胞间相互作用、中性细胞亚群及差异基因表达的分析。2、中性粒细胞群集调控SWCNT诱导肺组织炎症和纤维化的动物实验为了探讨中性粒细胞群集调控SWCNT诱导肺组织炎症和纤维化的机制,通过动物实验,在SWCNT暴露早期用GPCR脱敏抑制剂调节中性粒细胞群集,分析中性粒细胞群集对小鼠肺组织炎症和纤维化的影响。首先将8-10周龄C57BL/6J小鼠随机分为对照组、SWCNT组、不同剂量(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)GPCR脱敏抑制剂组,对照组和SWCNT组气管滴注分别给予PBS和40μg/只SWCNT,GPCR脱敏抑制剂组在SWCNT暴露后第0天分别腹腔注射0.2m L的12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml剂量的SB225002;在SWCNT暴露后第1、3、7天行肺功能检测,取肺组织检测炎症和纤维化,确定抑制剂最佳剂量。确定25μg/ml为GPCR脱敏抑制剂的最佳剂量后,8-10周龄C57BL/6J小鼠随机分为对照组Immune reconstitution、SWCNT组、SWCNT暴露后不同时间点(第1天和第2天)25μg/ml GPCR脱敏抑制剂组,对照组和SWCNT组气管滴注给予PBS或40μg/只SWCNT,GPCR脱敏抑制剂组在SWCNT暴露后第1、2天腹腔注射0.2m L的25μg/ml SB225002;在SWCNT暴露3天、7天和28天后进行肺功能检测,BALF中中性粒细胞形态、数量、功能、GPCR敏感性等评价,取肺组织检测炎症和纤维化。探讨中性粒细胞群集通过调控自身趋化因子表达、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和成纤维细胞-肌成纤维细胞转化(fibroblast-to-myofibroblast transition,FMT)介导SWCNT诱导小鼠肺组织炎症和纤维化的机制。3、GPCR调控中性粒细胞群集,介导SWCNT诱导趋化因子分泌、EMT及FMT的体外研究为了进一步验证SWCNT暴露诱导GPCR脱敏限制自身群集,调控EMT和FMT的机制,我们进行了体外研究。首先用SWCNT处理体外培养的中性粒细胞,在用和不用GPCR脱敏诱导剂或抑制剂的情况下,检测中性粒细胞GPCR敏感性、自身趋化因子表达、趋化功能和吞噬功能,验证SWCNT暴露诱导中性粒细胞GPCR敏感性降低,下调自身趋化因子表达,促进其群集自限的反馈调节;然后用SWCNT处理过的中性粒细胞,在用和不用GPCR脱敏诱导剂或抑制剂的情况下,分别与肺支气管上皮细胞或肺成纤维细胞进行共培养,检测肺支气管上皮细胞EMT的标志物E-cad与Vimentin,及肺成纤维细胞FMT的标志物α-SMA与COL I的表达情况,体外验证SWCNT暴露中后期诱导中性粒细胞GPCR脱敏,限制其群集,调控EMT和FMT的机制。4、GPCR调控中性粒细胞群集的分子机制4.1肺组织中性粒细胞亚群主要差异基因功能富集和通路分析为了深入探讨SWCNT诱导肺毒性中GPCR调控中性粒细胞群集的分子机制,首先对小鼠肺组织单细胞RNA测序结果进行中性粒细胞数量最多的C1、C2亚群主要差异基因KEGG富集分析和通路分析,寻求GPCR调控中性粒细胞群集的可能分子。4.2 K-ras调控趋化因子表达促进中性粒细胞群集SWCNT暴露小鼠早期肺组织单细胞RNA测序结果富集和通路分析显示,K-ras与SWCNT暴露早期的中性粒细胞群集相关,为了探究K-ras是否促进中性粒细胞群集及其可能机制,对SWCNT暴露诱导的肺损伤小鼠BALF中、体外培养的中性粒细胞中K-ras表达进行检测,分析K-ras与中性粒细胞自身趋化因子表达、GPCR敏感性和细胞定向趋化功能的关系;用体外实验,通过过表达和Si RNA干扰分别上调和下调中性粒细胞中K-ras表达,探讨K-ras对中性粒细胞GPCR敏感性、自身趋化因子表达及细胞定向趋化功能的调控作用。4.3 G蛋白偶联受体激酶K2(G protein-coupled receptor kinase-2,GRK2)/β-arrestin调控GPCR脱敏限制中性粒细胞群集SWCNT暴露小鼠肺组织单细胞RNA测序结果富集和通路分析显示,GRK2、β-arrestin与SWCNT暴露中晚期的中性粒细胞群集自限相关,为了探究GRK2、β-arrestin是否介导中性粒细胞群集自限及其可能机制,对SWCNT暴露诱导的肺损伤小鼠BALF中、体外培养的中性粒细胞中GRK2、β-arrestin表达进行检测,分析GRK2、β-arrestin与中性粒细胞自身趋化因子表达、GPCR敏感性和定向趋化功能的关系;用体外实验,过表达上调中性粒细胞中GRK2表达、Si RNA敲低质粒下调中性粒细胞中β-arrestin表达,探讨GRK2、β-arrestin对中性粒细胞GPCR敏感性、自身趋化因子表达及细胞定向趋化功能的调控作用。结果1、SWCNT诱导小鼠肺组织炎症和纤维化与中性粒细胞群集的关系1.1 SWCNT暴露引起小鼠肺部损伤早期以炎症为主,中晚期则主要为纤维化SWCNT暴露小鼠肺功能在暴露早期(1、3天)就开始降低,且随时间增加而愈发严重(P<0.05);SWCNT暴露早期,小鼠肺组织炎症细胞浸润均显著增多,BALF中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α含量均显著上升,但肺纤维化不明显;SWCNT暴露中(7天)晚(28、56天)期,小鼠肺组织炎症较早期有所减轻,但呈现出明显的胶原沉积,肺组织羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量和COL1、Vimentin、α-SMA表达明显高于PBS组,而E-cad表达相比于PBS组显著降低(P<0.05)。1.2中性粒细胞通过GPCR激活趋化因子表达和细胞内吞介导肺炎症和纤维化单细胞RNA测序结果分析显示,在SWCNT暴露早期和中期,共聚类29个细胞簇,鉴定到9个细胞类型,包括中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、浆细胞、红细胞。其中,中性粒细胞的数量差异最为显著、差异基因数量最多。细胞间相互作用分析中,SWCNT暴露早期,中性粒细胞发出和接收信号强度远高于除成纤维细胞外的其他细胞;SWCNT暴露中期,略高于除成纤维细胞外的其他细胞。中性粒细胞亚群分析共鉴定到6个亚群(C1~C6),其中C1、C2数量最多,在SWCNT暴露早中期的占比存在显著差异(P<0.001),C1、C2亚群差异基因数量在6个亚群中最多,共同差异基因中的28个属于炎症和纤维化共有相关基因,包括Cxcr4、Grk2、K-ras、Cxcl2、Smad3等。这28个差异基因中,GO富集分析显示6个富集到GPCR结合、15个富集到趋化因子反应相关条目,KEGG富集分析显示10个富集到趋化因子信号通路。主要趋化因子CXCL通路信号上,中性粒细胞是主要发送者和接收者,暴露早期主要协同巨噬细胞发挥作用;暴露中期主要协同成纤维细胞发挥作用。KEGG富集分析还发现,C1、C2亚群总的差异基因主要在Endocytosis、MAPK等信号通路中高度富集,尤其是Endocytosis信号通路,可能与中性粒细胞的吞噬作用有关,C1、C2亚群在该通路上有28个共有差异基因,显著上调的主要有Sh3kbp1、Cxcr4、Grk2等,Cxcr4与Grk2存在上下游调控关系,在趋化因子信号通路中也发挥重要作用。而Cxcr4是具有代表性的GPCR,Grk2主要参与GPCR的脱敏。1.3中性粒细胞GPCR敏感性调控SWCNT暴露小鼠肺部中性粒细胞群集SWCNT暴露小鼠,暴露早期肺组织中性粒细胞表面出现较多粒状突起、部分细胞出现破裂现象,且呈时间依赖性。与PBS组比,SWCNT暴露早期,BALF中中性粒细胞比例上升10倍以上,自身分泌趋化因子人白三烯B4受体1(human leukotriene B4 receptor 1,BLT1)、CXC受体2(CXC receptor 2,CXCR2)的表达和吞噬功能均显著上升,GPCR敏感性指标中性粒细胞钙离子浓度和瞬时内流显著升高(P<0.05),但GPCR脱敏关键调控因子GRK2表达无明显变化(P>0.05);暴露中晚期,与暴露早期相比,BALF中性粒细胞比例、自身趋化因子BLT1、CXCR2的表达和定向趋化、吞噬功能均显著下降,中性粒细胞钙离子浓度和瞬时内流明显降低;但是GRK2的表达显著升高(P<0.05)。2、中性粒细胞群集调控SWCNT诱导肺组织炎症和纤维化的动物实验剂量筛选实验结果显示GPCR脱敏抑制剂对中性粒细胞群集抑制效果最佳剂量为25μg/ml,且在SWCNT暴露早期,即暴露后第1天、2天进行处理,可以明显抑制中性粒细胞GPCR脱敏。2.1抑制GPCR脱敏上调SWCNT暴露早期趋化因子表达,增强定向趋化和吞噬功能,促进中性粒细胞的群集和功能SWCNT暴露后第1天GPCR脱敏抑制剂处理小鼠,与SWCNT组比,在暴露早期,肺组织中性粒细胞仍发生破裂和异常,BALF中中性粒细胞比例、BLT1和CXCR2蛋白表达明显升高,吞噬功能显著增强(P<0.05),但定向趋化功能无明显变化,钙离子浓度和瞬时内流明显升高(P<0.05),GRK2表达无明显变化(P>0.05);暴露中、晚期,肺组织中性粒细胞异常情况有所好转,BALF中中性粒细胞比例、BLT1和CXCR2蛋白表达显著升高,定向趋化和吞噬功能明显增强,钙离子浓度和瞬时内流显著升高,但GRK2表达显著降低(P<0.05)。SWCNT暴露后第2天GPCR脱敏抑制处理小鼠,与SWCNT组比,在暴露早期,肺组织中性粒细胞发生破裂和异常,BALF中中性粒细胞比例、BLT1和CXCR2蛋白表达明显升高,吞噬和定向趋化功能显著增强,钙离子浓度和瞬时内流明显升高(P<0.05),GRK2表达无明显变化(P>0.05);暴露中、晚期,肺组织中性粒细胞异常情况明显好转,BALF中中性粒细胞比例显著降低(接近于PBS组),BLT1和CXCR2蛋白表达显著升高、定向趋化和吞噬功能明显增强(且高于第1天处理组),钙离子浓度和瞬时内流显著升高(但低于第1天处理组),而GRK2表达显著降低(P<0.05)。2.2抑制GPCR脱敏减轻SWCNT暴露诱导的肺部炎症,缓解中晚期肺纤维化SWCNT暴露后第1天GPCR脱敏抑制剂处理小鼠,与SWCNT组比,暴露早期,肺组织有明显炎性浸润,BALF中IL-1β、TNF-α含量明显升高(P<0.05),肺组织未见明显胶原沉积,肺组织HYP含量和COL1、E-cad、Vimentin及α-SMA表达均无明显变化(P>0.05),肺功能指标Penh和EF50分别降低和升高(P<0.05);暴露中期,肺组织炎性浸润明显,BALF中IL-1β、TNF-α含量明显升高,肺组织胶原沉积明显缓解,肺组织HYP含量和COL1、Vimentin及α-SMA表达显著下降、E-cad表达显著升高,Penh和EF50分别下降和升高(P<0.05);暴露晚期,肺组织炎性浸润明显,但BALF中IL-1β、TNF-α含量均明显降低,肺组织胶原沉积明显好转,肺组织HYP含量和COL1、Vimentin及α-SMA表达明显降低、E-cad蛋白表达显著升高,Penh和EF50分别下降和升高(P<0.05)。SWCNT暴露后第2天GPCR脱敏抑制处理小鼠,与SWCNT组比,在暴露早期,肺组织有明显炎性浸润,BALF中IL-1β、TNF-α含量明显升高(P<0.05),但低于第1天处理组,肺组织未见明显的胶原沉积,HYP含量和COL1、E-cad、Vimentin及α-SMA的表达均无明显变化(P>0.05),Penh和EF50分别降低和升高(P<0.05);暴露中、晚期,肺组织炎性浸润明显缓解,BALF中IL-1β、TNF-α含量显著下降,肺组织胶原沉积显著好转,HYP含量和COL1、Vimentin及α-SMA的表达显著降低、E-cad表达显著升高,Penh显著下降、EF50显著升高(P<0.05)。3.GPCR调控中性粒细胞群集,介导SWCNT诱导趋化因子分泌、EMT及FMT的体外研究3.1 GPCR调控SWCNT诱导的中性粒细胞群集及其细胞功能与PBS组比,SWCNT处理的中性粒细胞,其形态出现较大异常,细胞表面有较多粒状突起、部分细胞出现破裂现象;钙离子水平显著下降,GRK2表达均显著升高,定向趋化功能和吞噬功能明显下降(P<0.05)。与SWCNT组比,SWCNT+GPCR脱敏诱导剂组中性粒细胞形态异常更为显著,钙离子水平显著下降,GRK2的表达均显著升高,定向趋化功能和吞噬功能明显下降(P<0.05);而SWCNT+GPCR脱敏抑制剂组中性粒细胞的形态异常有所改善,钙离子水平有所升高,GRK2的表达均显著下降,定向趋化功能和吞噬功能显著增强(P<0.05),且接近于PBS组。3.2 GPCR调控中性粒细胞群集及其功能,介导SWCNT诱导EMT及FMT与PBS组比,SWCNT处理的中性粒细胞中TGF-β1表达、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平及MPO、NE的含量均显著升高(P<0.05)。SWCNT处理的中性粒细胞可致共培养的人肺上皮细胞系(human Normal Lung Epithelial Cells,BEAS-2B)中Vimentin表达上调、E-cad表达下调,小鼠原代肺成纤维细胞中COL1和α-SMA表达上调(P<0.05)。与SWCNT组比,SWCNT+GPCR脱敏诱导剂处理的中性粒细胞TGF-β1表达、ROS水平及MPO、NE的含量均显著升高,致共培养的BEAS-2B细胞中Vimentin表达上调和E-cad表达下调,小鼠原代肺成纤维细胞的COL1和α-SMA表达上调(P<0.05);而SWCNT+GPCR脱敏抑制剂处理的中性粒细胞TGF-β1表达、ROS水平及MPO、NE的含量均明显降低(P<0.05),且致BEAS-2B的Vimentin表达下调、E-cad表达上调(P<0.05),小鼠原代肺成纤维细胞的COL1和α-SMA表达下调(P<0.05)。4、GPCR调控中性粒细胞群集的分子机制4.1 GPCR可能通过K-ras、GRK2、β-arrestin调控SWCNT暴露小鼠肺组织中性粒细胞的群集SWCNT暴露小鼠肺组织单细胞RNA测序结果生信分析显示,中性粒细胞C1、C2亚群中,与主要差异表达基因Cxcr4、Grk2共表达且起关键作用的基因有K-ras、β-arrestin、Sselleck化学mad3等。与PBS组比,SWCNT组小鼠肺组织中性粒细胞中,K-ras表达水平在暴露1天和3天显著上调,而暴露7天后明显下调;Grk2、β-arrestin表达水平在暴露1天和3天没有明显变化,而暴露7天后显著上调。4.2 K-ras调控SWCNT暴露早期中性粒细胞趋化因子表达及群集。小鼠BALF中性粒细胞中,相比于PBS组,SWCNT组、GPCR脱敏抑制剂组K-ras表达水平在暴露3天后明显上升,而在暴露7天、28天后显著降低(P<0.05);与SWCNT组比,GPCR脱敏抑制剂组在暴露7天、28天后显著升高(P<0.05)。进一步的细胞实验验证,体外培养中性粒细胞中,与PBS组比,SWCNT处理组K-ras表达水平显著降低(P<0.05);与SWCNT处理组比,SWCNT+GPCR脱敏诱导剂组的K-ras表达水平显著下降,而SWCNT+GPCR脱敏抑制剂组的K-ras表达水平明显升高(P<0.05)。中性粒细胞K-ras过表达显著上调自身趋化因子BLT1、CXCR2的表达,使SWCNT诱导的中性粒细胞钙离子浓度和瞬时内流明显升高,增强其GPCR敏感性和定向趋化功能(P<0.05);抑制中性粒细胞K-ras表达显著下调自身趋化因子BLT1、CXCR2的表达,使SWCNT诱导的中性粒细胞钙离子浓度和瞬时内流显著降低,导致GPCR脱敏,减弱细胞定向趋化功能(P<0.05)。4.3 GRK2/β-arrestin调控SWCNT暴露中晚期中性粒细胞GPCR脱敏限制其群集小鼠BALF中性粒细胞的GRK2、β-arrestin蛋白表达水平,相比于PBS组,SWCNT组在暴露3天后未见明显变化(P>0.05),而在暴露7天、28天后显著上升(P<0.05);相比于SWCNT组,GPCR脱敏抑制剂组在暴露7天、28天后显著降低(P<0.05)。进一步的细胞实验验证,体外培养的中性粒细胞中,与PBS相比,SWCNT处理组GRK2、β-arrestin表达水平显著升高(P<0.05);与SWCNT处理组比,SWCNT+GPCR脱敏诱导剂组的GRK2、β-arrestin表达水平显著上升,而SWCNT+GPCR脱敏抑制剂组的GRK2、β-arrestin表达水平明显降低(P<0.05)。与PBS组比,SWCNT组中性粒细胞钙离子水平显著降低,自身趋化因子BLT1、CXCR2表达水平明显下调(P<0.05),表明中性粒细胞GPCR脱敏,中性粒细胞群集自限,定向趋化功能下降。过表达中性粒细胞GRK2后GRK2、β-arrestin的表达水平进一步上调,而钙离子水平显著下降(P<0.05),BLT1、CXCR2的表达水平进一步下调,此时中性粒细胞GPCR进一步脱敏(P<0.05),定向趋化功能持续下降,中性粒细胞群集进一步自限;敲除中性粒细胞β-arrestin后β-arrestin的表达水平显著降低(P<0.05),GRK2的表达水平无明显变化(P>0.05),钙离子水平LY2157299供应商显著上升,BLT1、CXCR2的表达水平显著上调(P<0.05),此时中性粒细胞GPCR敏感性升高,定向趋化功能增强,中性粒细胞群集自限缓解;当过表达GRK2质粒与敲除β-arrestin质粒同时处理时,相比单独敲除β-arrestin质粒,中性粒细胞β-arrestin的表达水平明显升高(P<0.05),而钙离子水平显著下降(P<0.05),BLT1、CXCR2表达显著下调(P<0.05),此时中性粒细胞GPCR脱敏,定向趋化功能降低,中性粒细胞群集自限。以上表明:GRK2/β-arrestin调控GPCR脱敏介导中性粒细胞群集自限。结论1.SWCNT暴露早期诱导中性粒细胞GPCR敏感性增强从而促进其肺部有效群集,引起肺部炎症;暴露中晚期中性粒细胞GPCR脱敏限制其在肺部的有效群集,肺组织的急性炎症逐渐转变为低度的慢性炎症,并形成纤维化。2.SWCNT暴露早期中性粒细胞激活K-ras上调自身趋化因子分泌,增强GPCR敏感性,促进中性粒细胞肺组织群集,且增强其定向趋化和吞噬功能。3.SWCNT暴露中晚期,肺组织中通过群集而聚集的中性粒细胞通过激活自身GRK2-β-arrestin通路引起GPCR脱敏,限制中性粒细胞群集,且损伤定向趋化和吞噬功能。