癌症(也称为恶性肿瘤)是世界上最主要的威胁人类生命健康的疾病。癌症早期多无明显症状,即便有症状也常无特异性,等患者出现特异性症状时,常已经属于晚期,这对早期诊断癌症并为癌症患者提供治疗提出了巨大的挑Rapamycin核磁战。因此,癌症的早期发现、早期诊断和治疗对延缓患者病情、降低患者死亡率极为重要。肿瘤标志物是人体发生癌变时产生的,癌症早期会出现肿瘤标志物的表达异常。但早期肿瘤标志物的丰度很低,传统的检测方法存在灵敏度低、操作复杂selleck IACS-010759费时、需要大量样本等缺点,不能有效检测出早期癌症患者体内的特定肿瘤标志物,所以迫切需要开发更加灵敏精确检测肿瘤标志物的方法。幸运的是,近些年发展起来的单分子检测技术,特别是单分子荧光检测技术,具有高灵敏度、高分辨率、操作简便等优点,为癌症肿瘤标志物的早期检测和生物医学研究提供了一种新的方法。DNA糖基化酶和RNA去甲基化酶是非常重要的肿瘤标志物。人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(h OGG1)的异常表达可导致多种人类疾病,如帕金森氏病、自身免疫性疾病和不同类型的癌症(如乳腺癌、肺癌、口咽癌、结肠癌和胃癌)。N~6-甲基腺苷RNA去甲基酶(FTO)的异常表达可导致多种人类疾病,如II型糖尿病、肥胖、阿尔茨海默病、心血管疾病和癌症。本论文基于全内反射荧光显微镜(TIRF),发展了两种单分子荧光超灵敏生物传感器用于检测肿瘤标志物8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶和RNA去甲基化酶。具体内容如下:(1)我们构建了一种基于CRISPR-Cas的生物传感器,用于快速、灵敏地检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶。该传感器采用发夹探针,将二次链置换扩增(SDA)与CRISPR/Cas12a效应器相结合,具有快速(40 min内)和等温分析的特点。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的存在可以引发二次SDA在多核苷酸激酶(PNK)的辅助下产生大量的激活剂。随后,激活剂可以与cr RNA结合激活Cas12a,切割信号探针,恢复Cy5荧光,通过单分子成像可以准确定量。值得注意的是,设计的发夹探针可以有效阻止所产生的激活剂与游离发夹探针的杂交,使该生物传感器具有高灵敏度。此外,利用PNK代替脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1),大大简化了实验步骤,只需一步反应。单分子检测的引入进一步降低了样品消耗,提高了灵敏度。该生物传感器的检测下限为4.24×10~(-9) UμL~(-1),在单细胞水平上能准确定量细胞内的h OGG1。此外medical decision,该生物传感器还能应用于抑制剂的筛选、动力学参数的分析以及癌细胞和正常细胞的区分,在分子诊断和定点检测中具有潜在的应用前景。(2)我们开发了一种基于T7 RNA聚合酶辅助转录扩增和链霉亲和素(SA)适配体介导的荧光共振能量转移(FRET)组合的无标记单量子点(QD)纳米传感器,用于检测RNA去甲基化酶。所提出的纳米传感器利用N~6-甲基腺苷(m~6A)在延伸和连接反应中的阻碍效应来区分去甲基化的RNA和m~6A RNA。因此,RNA去甲基化酶的存在可以使m~6A RNA去甲基化,然后去甲基化的RNA可以介导延伸和连接反应,从而在核苷酸(ATP、GTP、UTP、CTP和Cy5-CTP)的引入下触发T7辅助转录扩增,产生掺入Cy5分子的SA适配体。生成的SA适配体可以自组装到链霉亲和素包被的605QD上,形成605QD-RNA-Cy5纳米结构,在605QD和Cy5之间引导FRET。这种纳米传感器利用生成的SA适配体作为原料来构建605QD-RNA-Cy5纳米结构,而不涉及任何荧光或生物素修饰。并且此纳米传感器还可以同时用于同源5(ALKBH5)去甲基酶的灵敏检测,这使得该纳米传感器有普遍的应用潜力。该生物传感器可以检测低至4.07 f M的FTO,并能在单细胞水平准确地检测细胞内的FTO。该纳米传感器具有超灵敏、高特异性和在单细胞水平上检测内源性RNA去甲基化酶的能力。此外,它还可用于酶动力学参数的测定和抑制剂的筛选,并可区分正常人和乳腺癌患者组织中RNA去甲基化酶的表达。这种纳米传感器在FTO相关疾病的临床诊断和药物开发中具有潜在的应用价值。