本研究以原代鸡肾小管上皮细胞为研究对象建立NIBV感染模型,旨在探究MDA5信号通路与NIBV致肾小管上皮细胞焦亡的关系以及千金藤碱的调控作用机制。本试验选用1-7日龄的海兰褐雏鸡,通过酶消化法建立原代鸡肾小管上皮细胞培养模型。用1 MOI SX9 NIBV接种细胞,分别在12 hpi、24 hpi、36 hpi获悉更多和48 hpi收取细胞,检测NIBV对肾小管上皮细胞焦亡和MDA5信号通路的影响。进一步选取NIBV对该细胞的刺激高峰点36 Bucladesine临床试验h,在攻毒后用20μM MDA5信号通路TRAF6抑制剂C25-140验证NIBV是否通过MDA5信号通路调控原代鸡肾小管上皮细胞焦亡,随后使用0.5μM千金藤碱探讨其是否能通过该机制治疗肾型传染性支气管炎。对收取的细胞检测以下指标:CCK8检测细胞活力,荧光定量PCR和免疫印迹法检测MDA5信号通路与细胞焦亡相关基因和蛋白以及NIBV的病毒载量和N蛋白的表达水平变化,酶标仪检测细胞上清LDH活性,荧光显微镜观察细胞焦亡水平,流式细胞仪检测细胞焦亡率,激光共聚焦观察NLRP3蛋白表达情况等。结果如下:1.与对照组相比,攻毒组LDH活性显著升高且呈时间依赖性(P<0.01)。且NIBV组病毒载量于36 hpi达到最高峰。流式和荧光结果表明,NIBV组细胞焦亡率极显著升高(P<0.01),焦亡水平极显著上升(P<0.01),基因和蛋白结果显示NIBV可上调MDA5、MAVS、TRAF6、TAK1、IKKα、IKKβ、NF-κB P65、NF-κB P50、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β的表达水平,说明NIBV能够激活MDA5信号通路并诱导细胞焦亡。2.20μM C25-140与NIBV共处理后,与NIBV组相比,N+C25-140组细胞LDH活性显著下降(P<0.05),NLRP3红色荧光点显著减少,流式和荧光结果显示焦亡率和焦亡水平显著下降(P<0.01),且MDA5信号通路和细胞焦亡相关基因和蛋白水平均被下调,病毒载量也显著降低(P<0.01),说明NIBV可通过激活MDA5/NF-κB信号通路调控鸡肾小管细胞焦亡。genetic population3.0.5μM千金藤碱与NIBV共处理后,与NIBV组相比,NIBV+CEP组LDH活力极显著下降(P<0.01),NLRP3红色荧光点显著减少,流式和荧光结果显示细胞焦亡率和细胞焦亡水平极显著下降(P<0.01),MDA5信号通路和细胞焦亡上述相关m RNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05或P<0.01),病毒拷贝数显著减少(P<0.05),且N蛋白表达量显著减少(P<0.05)。说明千金藤碱能够基于MDA5/NF-κB/NLRP3信号通路缓解NIBV导致的细胞焦亡。综上所述,NIBV感染诱发了由MDA5/NF-κB信号通路调控的细胞焦亡,且千金藤碱能够通过抑制MDA5/NF-κB/NLRP3信号通路缓解NIBV导致的肾小管上皮细胞细胞焦亡。