副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)现称为副猪格拉菌(Glaesserella parasuis)属于巴氏杆菌科,是一种革兰氏阴性、杆状、NAD依赖型细菌,属于条件致病菌,猪在应激或免疫力低下的状态时,该菌可引起以多发性浆膜炎为特征的格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)。HPS有高发病率和高死亡率的特征,给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。本研究先利用细胞Baf-A1浓度实验从45株HPS潜在毒力基因缺失菌株中筛选出符合条件的基因缺失弱毒疫苗的候选菌株,构建其对应的无痕缺失菌株并对其作为基因缺失弱毒疫苗的潜力做出评价。所取得的主要研究结果如下:1.细胞实验筛选毒力基因缺失菌株将45株HPS基因缺失菌株分别感染PAEC细胞,以HPS强毒Telaglenastat作用株SH0165作为阳性对照,PBS作为阴性对照,分别检测45株基因缺失菌株的细胞毒性,细菌感染细胞后细胞的IL-2和IFN-γ的表达情况。为了得到有较好免疫原性且能刺激产生高水平IL-2和IFN-γ表达的弱毒菌株,筛选出细胞毒性下降但未极显著下降,IL-2和IFN-γ表达水平上升的基因缺失菌株(p<0.05其统计值被认为是差异显著;p<0.01,其统计值被认为是差异极显著的)。从45株HPS基因缺失菌株中筛选出SH0165Δ2032和SH0165Δfic两株符合要求的缺失菌株。2.构建无痕基因缺失菌株构建了含有Methanocaldococcus jannaschii Argonaute(Mj Ago)的重组质粒,利用Mj Ago将HPS SH0165自然转化中同源重组的效率提高到1×10~(-2)CFU/ug,并筛选得到2032基因和fic基因的无痕缺失菌株。3.基因缺失株对仔猪的免疫保护实验将Sgenetic testH0165Δ2032和SH0165Δfic通过腹腔途径进行免疫,首免过后两周进行第二次免疫,商用疫苗和PBS空白对照组分别作为阳性和阴性对照,第二次免疫后两周用HPS强毒株SH0165攻毒。实验结果显示SH0165Δ2032和SH0165Δfic能够产生与商用疫苗免疫水平相当的抗体。我们从诱导产生的抗体水平、免疫攻毒前后的体温变化、免疫攻毒后仔猪的存活率、病理剖检病变、临床症状打分、组织载菌量、组织炎症因子以及组织病理切片等方面对基因缺失疫苗的免疫效果做了综合的评估,与商用疫苗相比,SH0165Δ2032能够诱导和商用疫苗相当的免疫保护效果,SH0165Δfic的保护效果优于商用疫苗。