目的:研究冬凌草甲素(oridonin,ORI)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠系膜细胞增殖和凋亡的影响及其可能的分子机制,为治疗系膜增生性肾小球肾炎提供新的思路与选择。方法1、体外实验:(1)不同浓度LPS作用于大鼠系膜细胞,CCK-8法确定LPS诱导细胞增殖的适当作用浓度和时间,建立系膜增生性肾小球肾炎细胞模型。(2)以适宜浓度的LPS为培养条件添加ORI,Edu检测法及CCK-8法selleck化学确定ORI对LPS诱导的系膜细胞增殖的影响。(3)Puromycin流式细胞术检测ORI对系膜细胞凋亡的影响。(4)转录组测序观察ORI对系膜细胞细胞的转录组信号通路的影响。(5)为进一步探讨ORI对系膜细胞细胞增殖的抑制及抗氧化能力的可能的分子机制,通过Western blot检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(B-cell Lymphoma 2,Bcl-2)与Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)的相对表达情况,以及氧化应激相关蛋白核因子(红系2)样蛋白2(nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2,NRF2)的表达情况。(6)用活性氧检测试剂盒通过免疫荧光显微镜及免疫荧光检测仪检测胞内ROS含量以探究ORI对LPS诱导的增殖的系膜细胞抗氧化能力的影响。(7)Western blot、免疫荧光检测及加ROS清除剂、NRF2抑制剂ML385确定OSGIN1、NRF2、ROS之间的关系。2、体内实验:留出昆明健康小鼠为阴性对照组,其余双后足垫皮下注射弗氏完全佐剂+BSA。此后腹腔注射BSA,共4周。分别于第l5天及第36天尾静脉注射LPS。其中,以正常昆明小鼠为阴性对照组,其余分别为模型组,低浓度治疗组(10 mg/kg ORI),高浓度治疗组(20 mg/kg ORI)。各组小鼠在造模后第0天开始腹腔注射给药/生理盐水,每天1次,治疗组喂以相应剂量ORI;对照组和模型组分别给以等量生理盐水,连续每日给药3周。给药完毕后一天脊椎脱臼法处死小鼠。常规HE染色,光学显微镜下观察并拍片,以检测药物对动物重大器官心脏、肺脏和肝脏的毒性作用;治疗结束后取肾组织分成若干份,一份肾组织做形态学检测,其他用于提取m RNA和蛋白检测等。结果:1、体外实验:(1)CCK-8法检测发现30μg/m L LPS作用24 h对系膜细胞细胞的增殖具有很好的诱导作用。(2)在30μg/m L LPS作用的基础上加入不同浓度的ORI(分别为3.13μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L),用Edu检测法及CCK-8法检测发现ORI对LPS诱导增殖的系膜细胞具有抑制作用,呈药物浓度依赖性。(3)流式细胞术检测表明25μmol/L ORI处理系膜细胞24 h,可诱导大部分系膜细胞走向凋亡,且以早期凋亡为主。(4)转录组测序发现ORI可诱导与细胞周期阻滞、增殖、凋亡相关诸多基因的差异表达,其中以氧化应激诱导生长抑制剂1(oxidative stress induced growth inhibitor 1,OSGIN1)的差异表达最为显著。(5)Western blot检测表明ORI可导致系膜细胞细胞Bax与Bcl-2比值上调,氧化应激相关蛋白NRF2表达上调。(6)免疫荧光显微镜及免疫荧光检测仪检测发现胞内ROS含量随ORI浓度的升高而升高。(7)Western blot检测发现NRF2及其下游靶基因HO-1表达随ORI浓度的升高而上调,免疫荧光显示NRF2入核增加。加NRF2抑制剂ML385刺激,Western Blot结果示OSGIN1与NRF2及NRF2下游靶基因HO-1均下调,验证了OSGIN1为NRF2下游基因。前面结果显示ORI可使系膜细胞内ROS水平明显升高,而用ROS清除剂NAC干预后,该作用得到抑制,且能逆转ORI抑制系膜细胞增殖的结果,同时ORI诱导上调表达的NRF2、OSGIN1也表达下调。2、动medical sustainability物实验表明ORI可改善小鼠慢性肾炎的病理症状,且通过激活NRF2依赖的OSGIN1途径对肾脏氧化损伤具有保护作用。结论:1.ORI抑制LPS诱导的大鼠系膜细胞增殖并促进其凋亡。2.ORI介导OSGIN1高表达以抑制大鼠系膜细胞增殖并促进其凋亡。3.ORI减少转录因子NRF2降解并促进其入核。4.ORI通过ROS介导其对NRF2的作用。5.ORI改善LPS诱导的小鼠慢性肾炎的病理表现。6.ORI介导NRF2-OSGIN1通路对小鼠慢性肾炎的肾脏保护作用。