免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)通过激活T淋巴细胞发挥肿瘤细胞杀伤作用成为肿瘤免疫治疗的重要药物,目前常用的ICIs主要包括针对程序性死亡受体1(Programmed death-1,PD-1)及其配体程序性死亡受体配体1(Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein4,CTLA-4)研发的系列抗体。ICIs引起的系列免疫相关不良反应(immune related adverse events,ir AEs)涉及多个器官组织,其中心脏毒性表现为心肌炎、心肌病、心肌缺血等,尽管心脏毒性发生率不高但具有致死的风险,特别是暴发性心肌炎具有较高的死亡率。研究ICIs引发心肌免疫损伤机制,寻找有效防治药物对该类药物的临床应用至关重要。一般认为ICIs引发ir AEs的原因包括自身抗体、细胞因子、T淋巴细胞介导的损伤等。由于基础研究中缺乏与临床相近的ICIs心脏免疫损伤动物/细胞模型,目前心肌组织病理资料主要来自临床组织病理学检查。结果显示绝大多数患者在组织学或血液中未发现自身抗体,心肌组织中存在过度活化的CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的浸润。近期研究发现,PD-1和CTLA-4基因敲除或ICIs的使用能激活心脏中识别心肌肌球蛋白的特异性T细胞,引发小鼠心功能异常。这表明T细胞浸润在ICIs介导的心脏损伤中发挥关键作用。T细胞介导的免疫损伤除了经典的Fas和穿孔素诱导的凋亡外,还包括坏死性凋亡、焦亡和铁死亡等途径。T细胞能够通过肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)特异性激活靶细胞受体相互作用蛋白激酶1(Receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)依赖性细胞死亡程序,使细胞执行坏死性凋亡。细胞毒性T细胞通过穿孔素特异性激活靶细胞中的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3),促进IL-1β成熟,诱导细胞焦亡,或通过颗粒酶A裂解GSDMB触发靶细胞的焦亡。在肿瘤免疫治疗中,CD8~+T细胞能够增强靶细胞中铁死亡特异性脂质过氧化作用,促进肿瘤细胞的铁死亡。然而,目前T细胞导致心肌细胞损伤的分子途径尚不明确。当前ICIs所致心脏免疫损伤的治疗方案以高剂量的皮质类固醇激素或其它免疫抑制剂为主,但大剂量激素产生诸多不良反应,免疫抑制剂会削弱ICIs的抗肿瘤效果。因此亟待基于药物毒理机制开发有效预防/治疗药物。实验表明,许多天然植物单体如小檗碱、姜黄素、白藜芦醇等对实验性自身免疫性心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis,EAM)具有保护作用。据此,本课题通过建立联合抗PD-1和抗CTLA-4所致小鼠心肌损伤模型和T细胞介导的人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)免疫损伤模型,探究T细胞介导心肌免疫损伤的分子途径,并基于损伤机制筛选对心肌有保护作用的天然药物,欲期为临床防治ICIs相关心脏免疫损伤提供实验依据。第一部分免疫检查点抑制剂致心脏免疫损伤模型的建立目的:建立抗PD-1和抗CTLA-4两种ICIs合用致小鼠心脏免疫损伤模型和T细胞介导的心肌细胞免疫损伤模型。方法:1.小鼠心脏免疫损伤模型:将小鼠随机分为抗PD-1和CTLA-4联合用药(ICIs)组和Ig G对照组。ICIs组腹腔注射Anti-PD-1抗体和Anti-CTLA-4抗体(均为300μg/只),每三天给药1次,共给药10次。最后一次给药后第三天进行心脏超声心动检测心功能、记录体表心电图。利用ELISA测定血清中心肌损伤标志物肌钙蛋白I(Cardiac troponin I,c Tn I)和肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase Myocardial Band,CKMB)。取心脏组织进行组织病理学评价和相关蛋白的检测。2.T细胞介导的心肌细胞免疫损伤模型:将分离的人T细胞(CD4~+:CD8~+=2:1)与hiPSC-CMs共培养,检测hiPSC-CMs的电活动(细胞外场电位:Extracellular field potential,EFP)、阻抗、释放的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)含量和相关蛋白的表达。结果:1.ICIs引起的小鼠心脏免疫损伤ICIs组小鼠血清中心肌损伤标志物c Tn I明显升高,CKMB有升高趋势。ICIs组小鼠心脏表面出现大片灰色或白色坏死区域,组织病理学显示心肌组织出现变性坏死,心肌细胞出现炎性病变,心肌纤维化水平升高,心肌组织中出现了CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的浸润。Western blot显示,与Ig G组相比,ICIs组小鼠心肌组织中PD-L1水平明显升高(3.02±0.07vs 1.00±0.45,n=4,P<0.05),脑利钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)表达明显升高(1.24±0.08 vs 1.00±0.07,n=4,P<0.01),IL-6的水平明显升高(2.89±0.42 vs 1.00±0.38,n=4,P<0.01)。与Ig G组相比,ICIs组小鼠的心电图参数包括PR/QTc间期并未表现出明显异常,小鼠左室功能包括左室射血分数、短轴缩短率及室壁厚度均无明显变化,仅一只小鼠显示出较低的射血分数(55.6%)。2.T细胞介导的心肌细胞免疫损伤hiPSC-CMs与T细胞共培养后,EFP出现多种形式的变化,主要表现为幅度的降低和搏动频率减慢,甚至出现停跳。这种变化具有T细胞数量依赖性和时间依赖性。对EFP变化严重程度进行量化打分,发现T细胞数量越多、共培养时间越长分值越高。阻抗能够反映贴壁细胞的细胞活力。T细胞使hiPSC-CMs的阻抗降低,这种作用同样具有T细胞数量依赖性和共培养时间依赖性。共培养phosphatidic acid biosynthesis48 h后T:C(T细胞与心肌细胞数量比)为1:1、3:1和5:1时hiPSC-CMs的阻抗分别下降至78%±10.3%(n=4,P>0.05),46.9%±5.7%(n=4,P<0.05)和40.0%±8.0%(n=4,P<0.05)。LDH的释放从另一个角度反映了T细胞对心肌细胞的损伤作用。hiPSC-CMs释放的LDH含量随T细胞数量和共培养的时间的增加而上升。与CON组(9.8×10~4±3.92×10~3,n=3)相比,在共培养48 h后,T:C为1:1、3:1和5:1时hiPSC-CMs的LDH释放量分别为:1.33×10~5±1.0×10~4,n=3,P<0.05;1.5×10~5±1.4×10~4,n=3,P<0.01;2.1×10~5±1.2×10~4,n=3,P<0.01。与T细胞共培养48 h后hiPSC-CMs PD-L1的表达明显升高(2.55±0.15 vs 1.00±0.01,n=3,P<0.01),心衰标志物BNP明显上调(1.46±0.15 vs 1.00±0.10,n=3,P<0.05)。小结:1.抗PD-1和抗CTLA-4两种ICIs合用能够引发小鼠心脏免疫性损伤,心肌组织有CD4~+和CD8~+T淋巴细胞浸润,并伴有血清中心肌损伤标志物的升高,与临床报道一致。2.建立了hiPSC-CMs与CD4~+和CD8~+T淋巴细胞共培养的心肌免疫损伤模型。第二部分T细胞介导心肌细胞免疫损伤的关键通路目的:利用hiPSC-CMs建立的细胞免疫损伤模型探究T细胞介导心肌细胞损伤的关键信号通路。方法:1.将hiPSC-CMs与CD4~+和CD8~+T淋巴细胞共培养后进行转录组学分析。通过差异基因聚类和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,Roxadustat使用方法KEGG)富集分析找到可能在T细胞介导的心肌细胞死亡中发挥作用的通路,并用PCR进行验证。2.根据转录组学的筛选结果,在T细胞介导的心肌细胞免疫损伤模型中观察不同通路抑制剂:焦亡抑制剂MCC950 sodium、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)、凋亡抑制剂Emricasan(Emr)和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)对hiPSC-CMs EFP、阻抗和LDH释放的影响结果:1.转录组学中差异基因表达分析、富集分析及验证转录组学结果显示,CON组和T细胞共培养组(Co-T cell)共检测到34662个基因表达,其中3433个基因上调,3005个基因下调,28224个基因表达水平没有变化。差异基因的疾病本体(Disease ontology,DO)分析显示差异基因与包括心肌梗死,充血性心力衰竭,心肌肥厚和心肌炎等在内的多种心脏疾病相关。转录组学中差异基因富集分析:差异基因共富集到了326条通路。其中包括含焦亡通路的NOD-like receptor signaling pathway(padj<0.05)、坏死性凋亡通路necroptosis(padj>0.05)、凋亡通路apoptosis(padj>0.05)和铁死亡通路ferroptosis(padj>0.05)。将富集通路进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)发现,与CON组相比,T细胞共培养组中焦亡、STING抑制剂坏死性凋亡和凋亡通路明显上调,铁死亡通路有上调趋势。和CON组相比,与T细胞共培养组焦亡通路相关基因Gsdmd和Il-1β明显上调(Gsdmd:21.3±1.3 vs 1.0±0.1,n=3,P<0.01;Il-1β:33.8±6.9 vs 1.0±0.3,n=3,P<0.05)。坏死性凋亡相关基因Mlkl也明显上调(13.0±0.6 vs 1.1±0.3,n=3,P<0.01)。坏死性凋亡和焦亡的交集基因Nlrp3明显上调(31.5±3.6 vs 1.0±0.2,n=3,P<0.01);凋亡通路相关基因Pmaip1上调(6.5±0.9 vs 1.0±0.1,n=3,P<0.05);铁死亡标志基因Ptgs2也上调(2.8±0.4 vs 1.0±0.1,n=3,P<0.05)。2.多种死亡通路的干预对T细胞介导的心肌免疫损伤的保护作用阻抗的变化:在与T细胞共培养48 h后,vehicle组阻抗较处理前降低(52.4%±9.0%,n=3),MCC950组、Emr组和Fer-1组削弱了T细胞引起的hiPSC-CMs阻抗降低(MCC950组:70.0%±4.5%,Emr组:79.1%±16.4%,和Fer-1组:72.4%±4.7%。n=3,P>0.05)。而Nec-1组明显抑制了T细胞导致的阻抗降低(113.0%±18%,n=3,P<0.05)。LDH的释放:与T细胞共培养组相比(1.2×10~5±9.9×10~2),各抑制剂组的LDH的释放有降低趋势(MCC950组:1.1×10~5±1.1×10~4,Nec-1组:9.46×10~4±1.2×10~4,Emr组:7.6×10~4±1.7×10~4,Fer-1组:9.5×10~4±1.7×10~4。n=3,P>0.05)。EFP的改变:vehicle组的hiPSC-CMs在24 h时电活动出现异常,主要表现为EFP幅值的降低、搏动频率的减慢和节律的紊乱。MCC950、Emr在24 h时hiPSC-CMs的EFP的搏动频率和幅度有一定保护,48 h时细胞EFP幅值略有下降。Fer-1仅在24 h对EFP有一定保护,48 h后出现了搏动节律的异常。Nec-1 24 h和48 h均对hiPSC-CMs的EFP有保护作用。小结:转录组学分析发现焦亡、坏死性凋亡、凋亡和铁死亡均参与了T细胞介导的心肌细胞损伤,其中坏死性凋亡为关键损伤途径。第三部分天然药物对T细胞介导心肌损伤的保护作用目的:根据T细胞介导的关键损伤途径,筛选出对心肌细胞有保护作用的天然产物。方法:1.通过HERB平台,根据坏死性凋亡通路中的关键基因进行基于靶点的筛选,获取对应的天然药物列表。将所得药物对应的靶点和疾病类型一并整合。制作“药物-靶点”和“药物-疾病”选择对多个基因有下调作用且与心脏疾病关联较多的药物进行下一步实验。2.在T细胞介导的心肌免疫损伤模型中观察筛选所得的天然药物白藜芦醇和姜黄素对心肌保护作用的实验验证。3.将白藜芦醇的靶基因与第二部分转录组学中所筛选到的差异基因进行配对制作韦恩图,并对重叠的靶基因进行KEGG富集分析。结果:1.药物的筛选:从数据库中共获取了102种天然药物与坏死性凋亡相关。“药物-靶点”网络图显示,有6种药物的靶点较多(Target≥4)。这6种药物分别是:epigallocatechin 3-gallate(表没食子儿茶素没食子酸酯),curcumin(姜黄素),cannabidiol(大麻二酚),eucalyptol(桉树脑),dioscin(薯蓣皂苷)和resveratrol(白藜芦醇)。“药物-疾病”网络图显示,其中白藜芦醇与17种心脏疾病相关,姜黄素与8种心脏疾病相关,属于关联最多的两种药物,因此选择白藜芦醇和姜黄素进行下一步验证。2.白藜芦醇和姜黄素对T细胞介导的心肌免疫损伤的保护作用T细胞导致阻抗持续降低,与vehicle组相比,白藜芦醇在48 h时能够部分恢复阻抗的降低(45%±8%,n=3,P<0.05),姜黄素则没有明显作用(28%±1%,n=3,P>0.05)。48 h时与CON组相比,T细胞组LDH释放明显升高(1.3×10~5±3.1×10~3,n=3,P<0.05),白藜芦醇和姜黄素预孵育使LDH释放量略有降低(白藜芦醇:8.4×10~4±2.7×10~4,n=3,P>0.05;姜黄素:8.5×10~4±1.3×10~4,n=3,P>0.05)。与T细胞共培养24 h后,hiPSC-CMs出现停跳,白藜芦醇和姜黄素预孵育在24 h时对EFP有保护作用,量化打分较低,但在48 h时两组EFP的幅值明显降低,分值升高。白藜芦醇能减轻T细胞对hiPSC-CMs造成的免疫损伤。3.白藜芦醇对T细胞导致的心肌免疫损伤靶点基因的富集分析:转录组学共有差异基因6438个,其中与白藜芦醇的226个靶点配对后发现,二者有67个重叠基因。将差异基因进行KEGG富集分析,共富集到包括坏死性凋亡、焦亡、凋亡和铁死亡在内的108条差异显著通路(padj<0.05)。结果证明,白藜芦醇的心肌保护作用不仅是通过抑制坏死性凋亡,也可能通过焦亡、凋亡和铁死亡途径来实现。小结:白藜芦醇能减轻T细胞介导的心肌细胞免疫损伤,这可能是通过抑制坏死性凋亡,焦亡,凋亡和铁死亡途径共同实现的。结论:本研究建立了抗PD-1和抗CTLA-4两种ICIs合用致心脏免疫性损伤的小鼠模型和T细胞介导的心肌细胞免疫损伤模型;坏死性凋亡是T细胞介导心肌细胞免疫损伤的关键通路;天然药物白藜芦醇能够减轻T细胞介导的心肌免疫损伤。