狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮常见且严重影响预后的并发症之一。儿童患者占比更大,早期和长期缓解可有效提高肾生存率。病初,血清中大量致病性自身抗体和免疫复合物可引起包括肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cell,GEC)在内的整个内皮系统发生氧化应激,其与免疫反应交互影响,是LN发生的始动因素之一。糖萼是内皮细胞的第一道屏障,主要成份是蛋白聚糖和糖胺聚糖。蛋白聚糖中的多配体聚糖-1(syndecan-1,SDC-1)与糖胺聚糖中的硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)相连接,构成糖萼的“骨架”。氧化反应使糖萼脱落,导致患儿血、尿中SDC-1、HS升高。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是氧化应激关键的转录因子,而血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是位于其下游重要的抗氧化酶。丁苯酞(dl-3n-butyphthalide,NBP)可活化Nrf2/HO-1抑制氧化损伤。然而,关于LN患儿GEC的氧化应激病变,血、尿中糖萼损伤后SDC-1、HS的水平及可能机制知之甚少。本课题对LN GEC病理特殊改变、糖萼成份脱落情况、相关损伤及保护机制进行了系列研究。第一部分 弥漫毛细血管内皮细胞增生狼疮性肾炎患儿的临床病理及短期预后目的:探讨儿童LN GEC弥漫增生在临床、病理、早期损伤、诱导治疗及疗效中的意义。方法:收集2012年3月至2021年10月初发初治在河北省儿童医院行肾穿刺活检术诊断LN(Ⅳ型)且于我院随访64例患儿的一般情况、化验报告、肾病理及短期预后资料(随访至少12月或出现死亡终点事件)。根据肾活检病理内皮细胞增生程度分为弥漫性GEC增生(A组)、局灶性GEC增生(B组)及无GEC增生(C组)三组,统计分析各组临床病理指标;根据诱导治疗后6月缓解情况分为完全缓解组及未完全缓解组,进行单因素、多因素分析。结果:64名LN(Ⅳ型)患儿中,A组23例(35.94%)显示存在弥漫性GEC增生。具有住院前病程短,高收缩压、SLEDAI增高,低补体C3、C4,高D-二聚体,SSA、SSB所占百分比低,尿中白细胞、红细胞、尿蛋白定量增高,肾小球滤过率降低的特点(P<0.05)。肾活检病理光镜合并微血栓、基底膜增厚例数增多,洋葱皮比例偏少(P<0.05)。A组有2例患儿诱导治疗期死亡,其余肾脏完全缓解时间明显短于其他两组(P<0.05)。影响诱导6月完全缓解单因素有病初GEC弥漫增生、补体C3、C4、D二聚体、血肌酐、尿红细胞、尿蛋白定量水平及肾小球合并微血栓情况(P<0.05)。多因素分析中弥漫性GAdezmapimod IC50EC增生和尿蛋白定量有统计学意义(P<0.05)。结论:LN患儿病初GEC的弥漫增生在临床、病理及诱导缓解方面与同型非弥漫增生患儿均有差别,应作为相对独立的一种亚型引起足够重视。LN患儿的GEC可能早期就参与到了该病的发病过程中。第二部分 糖萼损伤标志物在狼疮性肾炎患儿血、尿中的表达及可能机制目的:通过检测LN患儿血、尿标本中SDC-1、HS水平的变化及行肾活检LN患儿GEC中Nrf2、HO-1的表达,寻找糖萼脱落敏感标志物并阐明GEC损伤可能机制。方法:2020年10月至2022年10月初发初治于我院住院且治疗6月缓解的系统性红斑狼疮患儿34例资料。根据是否有肾脏受累分为LN组、非LN组。收集临床病理、治疗随访、血和尿标本齐全(治疗前、治疗后6月)且合格的患儿的资料。同期性别年龄匹配的健康患儿10例作为对照组。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血、尿标本SDC-1、HS水平,统计组间及治疗前后差异。LN行肾活检患儿18例匹配同期的轻微病变/微小病变患儿10例的病理切片。采用免疫组化法测GEC中Nrf2、HO-1的表达,统计组间差异。结果:治疗前,血、尿标本中SDC-1、HS在LN及非LN组之间无统计学差异(P>0.05),与对照组相比明显升高(P<0.05)。治疗后LN及非LN组血、尿SDC-1、HS两组比较无统计学差异(P>0.05)。LN、非LN两组治疗6月后血、尿SDC-1及HS与治疗前比较明显降低且有统计学差异(P<0.05)。LN组患儿肾病理GEC中Nrf2、HO-1表达明显高于对照组且有统计学意义(P<0.05)。结论:LN患儿发病初期血、尿标本中SDC-1及HS的水平增高,随LN患儿疾病缓解表达减低。糖萼脱落产物SDC-1、HS可作为LN疾病活动及评价治疗效果的标志物。LN患儿GEC损伤可能与Nrf2、HO-1在GEC中的异常表达有关。第三部分 丁苯酞通过激活Nrf2保护细胞糖萼机制研究目的:脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用于HK-2细胞建立体外细胞模型,验证NBP能否通过激活Nrf2抑制细胞氧化反应,稳定SDC-1、HS水平,减少糖萼损伤保护细胞。方法:筛选合适的实验LPS浓度、NBP浓度、Nrf2最佳siRNA序列。实验分为HK-2+siRNA NC、HK-2+Nrf2 siRNA、HK-2+siRNA NC+NBP、HK-2+Nrf2 siRNA+NBP、HK-2+LPS、HK-2+LPS+NBP六组。流式细胞检测各组细胞凋亡情况。RT-PCR方法检测Nrf2 mRNA的表达。蛋白印记检测目标蛋白NrfVE-822核磁2、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synth-ase,iNOS)、硫酸肝素蛋白多糖2(heparan sulfate proteoglycan 2,HSPG2)、SDC-1、血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)、血清组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)的表达;比较各组间差异。结果medical isolation:选择10μg/ml LPS作用于HK-2细胞建立细胞体外模型,100μM为NBP无毒性浓度,Nrf2 siRNA1900敲降效果最佳。转染Nrf2 siRNA显著降低Nrf2 mRNA的表达水平(P<0.05),同时也降低Nrf2、E-cadherin、HSPG2、SDC-1、TM、tPA蛋白的表达水平(P<0.05),显著增加iNOS的表达水平(P<0.05)。加入NBP处理增加Nrf2 mRNA及蛋白的表达水平(P<0.05),同时E-cadherin、HSPG2、SDC-1、TM、tPA蛋白的表达水平也增加(P<0.05),显著降低iNOS的表达水平(P<0.05)。结论:丁苯酞通过激活Nrf2使HK-2细胞体外模型中iNOS蛋白降低,Nrf2、E-cadherin、HSPG2、SDC-1、TM、tPA蛋白表达增加,保护糖萼,减少了细胞的凋亡。